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[發明專利]一種家蠶氣味結合蛋白BmOBP2的表達純化方法有效

專利信息
申請號: 201310025720.9 申請日: 2013-01-22
公開(公告)號: CN103103209A 公開(公告)日: 2013-05-15
發明(設計)人: 張耀洲;劉玲玲;杜瑤瑤;陳劍清;舒特俊 申請(專利權)人: 天津耀宇生物技術有限公司
主分類號: C12N15/70 分類號: C12N15/70;C07K14/435;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C07K1/18
代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228 代理人: 張瑾
地址: 300457 天津市濱海新區經濟技術開發區*** 國省代碼: 天津;12
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摘要:
搜索關鍵詞: 一種 家蠶 氣味 結合 蛋白 bmobp2 表達 純化 方法
【權利要求書】:

1.一種家蠶氣味結合蛋白BmOBP2的表達純化方法,其特征在于,包括以下步驟:

(a)?BmOBP2基因的合成;

(b)分別用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ對BmOBP2基因和載體進行雙酶切,連接構建重組表達載體;

(c)轉化表達菌,培養,誘導表達重組目的蛋白;

(d)純化目的蛋白。

2.如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述步驟(a)具體包括:

(1)設計上游引物F:?5’-CGCGGATCCATGAAGAGCAAAACAAAAC-3’,下劃線為限制性內切酶BamHⅠ酶切位點);

下游引物R:?5’-CCGCTCGAGTTATAGTTCATCTTTAAC-3’,下劃線為限制性內切酶XhoⅠ酶切位點;?

(2)以家蠶蠶蛹cDNA為模板,用所設計引物F和R擴增特異性片段,具體程序為:94℃預變性5min,94℃變性1?min,62℃退火45s,72℃延伸30s,循環30次;最后72℃延伸10?min,回收產物得到BmOBP2基因,其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

3.如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述步驟(b)具體包括:

BmOBP2基因和pET-32a載體利用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ同時進行雙酶切,將酶切回收的產物用Ligation?High室溫連接30min,并轉化E.coli?TG1感受態細胞,挑取單菌落搖菌培養后提取重組表達載體pET-32a-BmOBP2。

4.如權利要求3所述的方法,其特征在于,所述步驟(b)中的重組表達載體pET-32a-?BmOBP2通過堿裂法提取重組質粒。

5.如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述步驟(c)具體包括:

將PCR鑒定和雙酶切鑒定正確且測序正確的表達載體轉化至E.coli?BL21(DE3)中,得到重組菌,在含50?mg/mL氨芐青霉素的LB培養基中37℃,220?rpm振蕩培養至OD600=0.5,加入終濃度為1?mM?的異丙基-Β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),37℃誘導表達5h,得到重組目的蛋白His-BmOBP2。

6.如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述步驟(d)?具體包括:

(1)將得到的可溶的重組重組蛋白通過0.45μm纖維素膜過濾后,與鎳離子親和層析柱結合,用不同濃度的咪唑緩沖液進行洗滌;

(2)經純化條件的摸索,用濃度為20?mM、50?mM的咪唑緩沖液洗脫雜蛋白,用濃度為150?mM的咪唑緩沖液洗脫重組目的蛋白His-BmOBP2。

7.如權利要求6所述的方法,其特征在于,所述步驟(1)中咪唑緩沖液的濃度為20Mm、50mM、80mM、100mM、150mM、200mM、500mM。

8.如權利要求7所述的方法,其特征在于,所述步驟(2)中洗滌條件的摸索的具體操作為:取10ml的上清液與2ml的鎳離子親和層析柱填料結合,反復3次,每次4℃溫和震蕩孵育10?min,以所述步驟(1)中所述不同濃度的咪唑緩沖液進行洗脫,分別洗滌20ml;其中上述上清液為所述步驟(c)所得重組目的蛋白經超聲破碎后,4℃,12000rpm離心20?min后的上清液。

9.如權利要求8所述的方法,其特征在于,所述步驟(2)中超聲功率為60%,超聲總時間為4s。

10.如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法在步驟(a)之前還包括:

經家蠶蠶蛹cDNA文庫篩選,篩選出一條家蠶氣味結合蛋白BmOBP2,通過SignalP4.0?Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對BmOBP2進行信號肽預測,并經TMHMM服務器http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM對該蛋白進行跨膜區分析,得知此蛋白是含有一個跨膜區的膜蛋白。

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