[發明專利]一種家蠶氣味結合蛋白BmOBP2的表達純化方法

有效

• 申請號: 201310025720.9
• 申請日: 2013-01-22
• 公開（公告）號: CN103103209A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 張耀洲;劉玲玲;杜瑤瑤;陳劍清;舒特俊
• 申請（專利權）人: 天津耀宇生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/435;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C07K1/18
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 張瑾

1.一種家蠶氣味結合蛋白BmOBP2的表達純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

(a)?BmOBP2基因的合成；

(b)分別用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ對BmOBP2基因和載體進行雙酶切，連接構建重組表達載體；

(c)轉化表達菌，培養，誘導表達重組目的蛋白；

(d)純化目的蛋白。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)具體包括：

(1)設計上游引物F:?5’-CGCGGATCCATGAAGAGCAAAACAAAAC-3’，下劃線為限制性內切酶BamHⅠ酶切位點)；

下游引物R：?5’-CCGCTCGAGTTATAGTTCATCTTTAAC-3’，下劃線為限制性內切酶XhoⅠ酶切位點；?

(2)以家蠶蠶蛹cDNA為模板，用所設計引物F和R擴增特異性片段，具體程序為：94℃預變性5min，94℃變性1?min，62℃退火45s，72℃延伸30s，循環30次；最后72℃延伸10?min，回收產物得到BmOBP2基因,其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)具體包括：

BmOBP2基因和pET-32a載體利用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ同時進行雙酶切，將酶切回收的產物用Ligation?High室溫連接30min，并轉化E.coli?TG1感受態細胞，挑取單菌落搖菌培養后提取重組表達載體pET-32a-BmOBP2。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)中的重組表達載體pET-32a-?BmOBP2通過堿裂法提取重組質粒。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(c)具體包括：

將PCR鑒定和雙酶切鑒定正確且測序正確的表達載體轉化至E.coli?BL21(DE3)中，得到重組菌，在含50?mg/mL氨芐青霉素的LB培養基中37℃，220?rpm振蕩培養至OD₆₀₀=0.5，加入終濃度為1?mM?的異丙基-Β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，37℃誘導表達5h，得到重組目的蛋白His-BmOBP2。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(d)?具體包括：

(1)將得到的可溶的重組重組蛋白通過0.45μm纖維素膜過濾后，與鎳離子親和層析柱結合，用不同濃度的咪唑緩沖液進行洗滌；

(2)經純化條件的摸索，用濃度為20?mM、50?mM的咪唑緩沖液洗脫雜蛋白，用濃度為150?mM的咪唑緩沖液洗脫重組目的蛋白His-BmOBP2。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中咪唑緩沖液的濃度為20Mm、50mM、80mM、100mM、150mM、200mM、500mM。

8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中洗滌條件的摸索的具體操作為：取10ml的上清液與2ml的鎳離子親和層析柱填料結合，反復3次，每次4℃溫和震蕩孵育10?min，以所述步驟(1)中所述不同濃度的咪唑緩沖液進行洗脫，分別洗滌20ml；其中上述上清液為所述步驟(c)所得重組目的蛋白經超聲破碎后，4℃，12000rpm離心20?min后的上清液。

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中超聲功率為60%，超聲總時間為4s。

10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在步驟(a)之前還包括：

經家蠶蠶蛹cDNA文庫篩選，篩選出一條家蠶氣味結合蛋白BmOBP2，通過SignalP4.0?Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對BmOBP2進行信號肽預測，并經TMHMM服務器http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM對該蛋白進行跨膜區分析，得知此蛋白是含有一個跨膜區的膜蛋白。