[發明專利]快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條及其制備方法

無效

• 申請號: 201310024101.8
• 申請日: 2013-01-23
• 公開（公告）號: CN103116022A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發明（設計）人: 秦毅斌;李斌;趙武;梁家幸;何穎;梁保忠;蘇乾蓮;閉炳芬;陳忠偉;段群棚;盧冰霞
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術領域

本發明屬于豬乙型腦炎檢測技術領域，尤其是一種快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條及其制備方法。

背景技術

日本乙型腦炎(Japanese?encephalitis?B，JE)，又稱流行性乙型腦炎、乙型腦炎，簡稱乙腦，是由日本乙型腦炎病毒(Japanese?encephalitis?virus，JEV)引起的一種人畜共患的蚊媒傳播的自然疫源性傳染病。該病對人類危害巨大，是人類中樞神經系統最常見的蟲媒病之一，可導致患者死亡并常留下嚴重的神經后遺癥。在動物中，豬是JE的主要傳染源，對JEV有擴增作用，JEV感染一般呈豬-蚊-人的鏈狀。JE可以引起懷孕母豬流產、死產或弱仔，公豬睪丸炎以及仔豬出現神經癥狀，給養豬業造成較大的經濟損失。JEV廣泛分布于亞洲各國，近年來其流行分布范圍有不斷擴大的趨勢，原先無JE的澳大利亞等國已經出現病例。我國是JE發病人數最多的國家，占世界總發病數的80%以上。由于JE流行范圍廣、人獸共患、危害嚴重，世界衛生組織（WHO）將其列為需要重點控制的傳染病，也是我國醫學乙類法定傳染病。國際獸醫局（OIE）規定JE為必須報告的動物疫病，屬二類動物疫病。

JEV屬于黃病毒科黃病毒屬成員，基因組為正鏈單股RNA病毒，基因組長度約為11kb(10976bp)，整個基因組只含一個開放閱讀框。該多蛋白前體經蛋白酶切割加工，產生3個結構蛋白：核衣殼蛋白(C)、膜蛋白(PrM／M)、囊膜糖蛋白(E)。E蛋白基因大小為1500bp，由其編碼的E蛋白是病毒粒子表面最重要的結構蛋白，其表面的抗原決定簇，具有血凝活性和中和活性。E蛋白與病毒的毒力、保護性免疫、宿主范圍、組織嗜性、膜融合、血凝反應和血清特異性有關。

傳統診斷JEV的血清學方法有血清中和試驗(SNT)、血凝抑制試驗(HI)、補體結合試驗(CT)、間接免疫熒光試驗(IFA)等，目前較常用有乳膠凝集試驗(LAT)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等。這些檢測方法存在耗時長、專業性強等缺點，操作需要專門的技術人員和儀器設備，不適合基層使用。因此，建立一種快速、直觀、簡便、適合基層使用的JEV診斷方法對養豬生產單位具有重要的意義。

免疫膠體金技術(Immune?Colloidal?gold?technique，ICG)是20世紀80年代繼熒光標記、放射性同位素標記和酶標記三大標記技術后發展起來的一種新型固相標記免疫測定技術。其原理是以膠體金為標記物，利用抗原抗體特異性反應，通過帶顏色的膠體金顆粒來放大免疫反應系統，使反應結果在固相載體上直接顯示出來，用于檢測被檢樣品中的抗原或抗體。該方法具有特異性強、敏感性高、快速便捷、無需要特殊儀器設備、結果讀取判斷直觀等優點，已成為當前動物疫病檢測中廣泛采用的免疫學檢測方法之一。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種特異性強、敏感性高、操作簡單便捷的快速檢測豬乙型腦炎抗體（JEV抗體）試紙條及其制備方法，以幫助進行JE血清學診斷與血清流行病學調查以及JE感染或免疫后血清抗體的檢測。

本發明所要解決的技術問題通過以下技術方案來實現：快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條，由吸水紙、硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、樣品墊、支持物組成，硝酸纖維素膜含有由JEV?E蛋白包被而成的檢測線和由羊抗JEV抗體包被而成的對照線，玻璃纖維素膜結合有膠體金標記的JEV?E蛋白。

用于包被檢測線的JEV?E蛋白濃度為1.56mg/mL，用于包被對照線的羊抗JEV抗體濃度為2mg/mL。

玻璃纖維素膜、硝酸纖維素膜和吸水紙按照以下次序相連接并附著在支持物上面，玻璃纖維素膜與靠近硝酸纖維素膜檢測線的一端相連接，吸水紙與靠近硝酸纖維素膜對照線的一端相連接；樣品墊附著在玻璃纖維素膜上，樣品墊的一端與硝酸纖維素膜相連接。

硝酸纖維素膜上的檢測線和對照線的直接間隔為3～5mm，4mm最佳。

支持物要求具有一定硬度，便于將樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸水紙負載于其上，能夠達到支持和負載的目的即可。支持物首選塑料板（PVC），也可以選擇鋁板、硬紙板作為支持物。

上述快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條的制備方法，包括以下步驟：

<1>JEV?E蛋白的制備?可按照常規基因工程手段進行，如E基因重組質粒誘導表達蛋白，以親和層析法對重組蛋白進行純化，谷胱甘肽還原法進行復性，經透析、濃縮及紫外分光度計測定后備用；