[發明專利]一種脂肪細胞中自噬的監測方法有效
| 申請號： | 201310023764.8 | 申請日： | 2013-01-22 |
| 公開（公告）號： | CN103060421A | 公開（公告）日： | 2013-04-24 |
| 發明（設計）人： | 寧光;鄧玉杰;楊穎;張志國 | 申請（專利權）人： | 上海市內分泌代謝病研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/02 | 分類號： | C12Q1/02;C12N15/867;G01N33/68 |
| 代理公司： | 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227 | 代理人： | 吳瑾瑜 |
| 地址： | 200025 *** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 脂肪 細胞 監測 方法 | ||
【權利要求書】：
1.一種脂肪細胞中自噬的監測方法，其特征在于，包括以下步驟：
（1）培養及誘導分化3T3-L1前脂肪細胞獲得成熟的脂肪細胞，用0.2%BSA-DMEM孵育12h，裂解所獲得的脂肪細胞，抽提其蛋白質；
（2）采用BCA法對蛋白質進行定量，計算所獲得的蛋白質樣品的濃度，然后進行蛋白免疫印跡分析；
（3）以小鼠的肝臟cDNA為模板，根據Genebank的小鼠LC3b基因編碼區設計引物，根據載體質粒上的多克隆位點選擇LC3編碼區不含有的酶切位點加入到引物的上下游，上游引物的序列為：CCGCTCGAGATGCCGTCCGAGAAGACC，酶切位點為XhoⅠ；下游引物的序列為CGCGGATCCCCCTGTCGTTACCGACACATT，酶切位點為BamHⅠ；PCR產物割膠回收，擴增出LC3b?DNA片段，取雙酶切后的的LC3片段和的pLVX-IRES-ZsGreen1進行T4DNA連接酶連接，培養產物，提取質粒，取酶切驗證后的質粒進行測序分析；
（4）用PlVX-LC3-IRES-ZsGreen1質粒，delta8.9質粒和VSVG轉染293T細胞，收集病毒上清，進行慢病毒滴度的測定；
（5）病毒轉染成熟3T3-L1脂肪細胞，共聚焦顯微鏡觀察及電鏡觀察自噬體。
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