[發(fā)明專利]穩(wěn)定表達(dá)6個(gè)HMW-GS的普通小麥培育方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310022735.X
• 申請日: 2013-01-22
• 公開（公告）號: CN103039357A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 伍碧華;王真真;胡喜貴;胡繼良;郭孝輝;王棟;鄭有良;劉登才;蒲至恩;陳國躍;代壽芬
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: A01H1/02
• 分類號: A01H1/02
• 代理公司: 成都天嘉專利事務(wù)所(普通合伙) 51211
• 代理人: 趙麗

1.一種穩(wěn)定表達(dá)6個(gè)HMW-GS的普通小麥培育方法，其特征在于：以普通小麥為母本，野生二粒小麥為父本，將擁有4個(gè)HMW-GS的野生二粒小麥的花粉，授予六倍體的普通小麥，通過種間遠(yuǎn)緣雜交、多代自交及鑒定，選育出穩(wěn)定表達(dá)6個(gè)HMW-GS的普通小麥。

2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定表達(dá)6個(gè)HMW-GS的普通小麥培育方法，其特征在于：所述母本選自高產(chǎn)但加工品質(zhì)差的普通小麥，染色體組型為AABBDD，具有4個(gè)高分子量谷蛋白亞基，其1Ay亞基編碼基因處于沉默態(tài)，具有序列表中SEQ?ID?NO.1-3所述的堿基、核苷酸及氨基酸序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定表達(dá)6個(gè)HMW-GS的普通小麥培育方法，其特征在于：所述父本選自Glu-A1和Glu-B1位點(diǎn)均表達(dá)的含有4個(gè)高分子量谷蛋白亞基的野生二粒小麥，染色體組型為AABB，其活性態(tài)的1Ay亞基基因具有序列表中SEQ?ID?NO.4-5所述的堿基、核苷酸及氨基酸序列。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定表達(dá)6個(gè)HMW-GS的普通小麥培育方法，其特征在于：所述雙親的雜交，是抽穗后對母本穗進(jìn)行人工去雄，套上硫酸紙袋以防飛花，授以野生二粒小麥花粉后繼續(xù)套袋直至成熟。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定表達(dá)6個(gè)HMW-GS的普通小麥培育方法，其特征在于：所述多代自交及鑒定包括如下方法步驟：

A、將經(jīng)雜交產(chǎn)生的種子進(jìn)行SDS-PAGE分析，并對其根尖體細(xì)胞染色體數(shù)目進(jìn)行檢測，選擇具有雙親HMW-GS條帶的、染色體數(shù)目為35條的雜種F₁代植株；

B、將經(jīng)步驟A選取出的F₁代植株在抽穗后套上硫酸紙袋自交，收取F₂代種子，按步驟A所述方法進(jìn)行SDS-PAGE分析和染色體數(shù)目檢測，選取35≤2n≤42和HMW-GS為6條的籽粒繼續(xù)種植套袋自交得F₃代，再按步驟A所述方法對F₃代籽粒進(jìn)行檢測和選取；

C、對步驟B獲選的F₃代種子進(jìn)行發(fā)芽移栽，并自交，連續(xù)自交6代后獲得F₈代，且每代均選取株葉型、抽穗期、開花期、成熟期趨向母本普通小麥的單株；

D、隨機(jī)抽取F₈代單株，?再從各單株收獲籽粒中隨機(jī)選取8粒，按步驟A所述的SDS-PAGE方法進(jìn)行HMW-GS檢測；選取具有6個(gè)HMW-GS的籽粒進(jìn)行發(fā)苗移栽獲得F₉代植株，再自交，收獲F₉代植株上產(chǎn)生的F₁₀代籽粒，再隨機(jī)選取8粒按同樣方法進(jìn)行SDS-PAGE分析，對HMW谷蛋白亞基進(jìn)行檢測；然后再對HMW谷蛋白亞基譜帶數(shù)均為6條，且電泳遷移率一致，并含有父本野生二粒小麥Glu-A1和Glu-B1位點(diǎn)y-型亞基的上述8粒籽粒，進(jìn)一步按步驟A所述方法進(jìn)行染色體數(shù)目均為2n=42的根尖染色體數(shù)目檢測；

E、將步驟D選取的雜種F₁₀代種子，同時(shí)與母本及父本的種子進(jìn)行室內(nèi)發(fā)芽，剪取幼嫩葉片提取基因組DNA，然后對HMW-GS編碼基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選取1Ay的條帶進(jìn)行轉(zhuǎn)化、陽性檢測、測序和序列比較分析；

F、將步驟E獲得的F₁₀代種子與母本及父本的核苷酸及其氨基酸序列進(jìn)行比較分析，確認(rèn)雜種育成小麥的Glu-A1位點(diǎn)活性y型亞基編碼基因與父本野生二粒小麥的Glu-A1位點(diǎn)活性y型亞基編碼基因序列高度一致，均具有1830bp的核苷酸長度，都沒有缺失/插入?yún)^(qū)段，都能編碼608個(gè)氨基酸殘基，且沒有提前終止密碼子，均屬于活性態(tài)的Ay基因；而母本普通小麥Ay等位基因的核苷酸序列短于父本和育成小麥，為1791bp，而且其DNA分子結(jié)構(gòu)上存在著3個(gè)區(qū)段的缺失，其中間重復(fù)區(qū)還存在1個(gè)提前終止密碼子，處于沉默態(tài)，由此而確定野生二粒小麥Glu-A1位點(diǎn)的活性y型亞基編碼基因已真實(shí)導(dǎo)入普通小麥基因組；

G、對步驟F鑒定的雜種后代中的活性Ay等位基因進(jìn)行染色體工程遺傳重組特性分析，確認(rèn)育成普通小麥所擁有的活性Ay基因的DNA序列，在保持父本98.9%的1Ay基因核苷酸的同時(shí)，還存在21個(gè)單核苷酸的變異，其中14個(gè)位點(diǎn)為突變，7個(gè)位點(diǎn)為整合了母本普通小麥的核苷酸；

H、對經(jīng)步驟G確定的育成普通小麥的1Ay基因的編碼亞基活性進(jìn)行異源表達(dá)分析，以證明育成普通小麥所擁有的1Ay?基因與父本野生二粒小麥的1Ay基因一樣具有編碼1Ay亞基的功能；

I、將經(jīng)步驟D-H鑒定后獲選的雜種種子的具有種胚的半粒進(jìn)行培養(yǎng)皿內(nèi)發(fā)芽移栽，再連續(xù)自交2代獲得F₁₁和F₁₂代；繼續(xù)對F₁₁和F₁₂代的籽粒按步驟A的SDS-PAGE方法進(jìn)行HMW-GS檢測，以進(jìn)一步證明其擁有的6個(gè)HMW-GS能在普通小麥遺傳背景中穩(wěn)定傳遞。