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[發(fā)明專利]穩(wěn)定表達(dá)6個(gè)HMW-GS的普通小麥培育方法有效

專利信息
申請(qǐng)?zhí)枺?/td> 201310022735.X 申請(qǐng)日: 2013-01-22
公開(公告)號(hào): CN103039357A 公開(公告)日: 2013-04-17
發(fā)明(設(shè)計(jì))人: 伍碧華;王真真;胡喜貴;胡繼良;郭孝輝;王棟;鄭有良;劉登才;蒲至恩;陳國(guó)躍;代壽芬 申請(qǐng)(專利權(quán))人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
主分類號(hào): A01H1/02 分類號(hào): A01H1/02
代理公司: 成都天嘉專利事務(wù)所(普通合伙) 51211 代理人: 趙麗
地址: 611130 四川省成都市溫*** 國(guó)省代碼: 四川;51
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摘要:
搜索關(guān)鍵詞: 穩(wěn)定 表達(dá) hmw gs 普通 小麥 培育 方法
【權(quán)利要求書】:

1.一種穩(wěn)定表達(dá)6個(gè)HMW-GS的普通小麥培育方法,其特征在于:以普通小麥為母本,野生二粒小麥為父本,將擁有4個(gè)HMW-GS的野生二粒小麥的花粉,授予六倍體的普通小麥,通過(guò)種間遠(yuǎn)緣雜交、多代自交及鑒定,選育出穩(wěn)定表達(dá)6個(gè)HMW-GS的普通小麥。

2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定表達(dá)6個(gè)HMW-GS的普通小麥培育方法,其特征在于:所述母本選自高產(chǎn)但加工品質(zhì)差的普通小麥,染色體組型為AABBDD,具有4個(gè)高分子量谷蛋白亞基,其1Ay亞基編碼基因處于沉默態(tài),具有序列表中SEQ?ID?NO.1-3所述的堿基、核苷酸及氨基酸序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定表達(dá)6個(gè)HMW-GS的普通小麥培育方法,其特征在于:所述父本選自Glu-A1Glu-B1位點(diǎn)均表達(dá)的含有4個(gè)高分子量谷蛋白亞基的野生二粒小麥,染色體組型為AABB,其活性態(tài)的1Ay亞基基因具有序列表中SEQ?ID?NO.4-5所述的堿基、核苷酸及氨基酸序列。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定表達(dá)6個(gè)HMW-GS的普通小麥培育方法,其特征在于:所述雙親的雜交,是抽穗后對(duì)母本穗進(jìn)行人工去雄,套上硫酸紙袋以防飛花,授以野生二粒小麥花粉后繼續(xù)套袋直至成熟。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定表達(dá)6個(gè)HMW-GS的普通小麥培育方法,其特征在于:所述多代自交及鑒定包括如下方法步驟:

A、將經(jīng)雜交產(chǎn)生的種子進(jìn)行SDS-PAGE分析,并對(duì)其根尖體細(xì)胞染色體數(shù)目進(jìn)行檢測(cè),選擇具有雙親HMW-GS條帶的、染色體數(shù)目為35條的雜種F1代植株;

B、將經(jīng)步驟A選取出的F1代植株在抽穗后套上硫酸紙袋自交,收取F2代種子,按步驟A所述方法進(jìn)行SDS-PAGE分析和染色體數(shù)目檢測(cè),選取35≤2n≤42和HMW-GS為6條的籽粒繼續(xù)種植套袋自交得F3代,再按步驟A所述方法對(duì)F3代籽粒進(jìn)行檢測(cè)和選?。?!-- SIPO -->

C、對(duì)步驟B獲選的F3代種子進(jìn)行發(fā)芽移栽,并自交,連續(xù)自交6代后獲得F8代,且每代均選取株葉型、抽穗期、開花期、成熟期趨向母本普通小麥的單株;

D、隨機(jī)抽取F8代單株,?再?gòu)母鲉沃晔斋@籽粒中隨機(jī)選取8粒,按步驟A所述的SDS-PAGE方法進(jìn)行HMW-GS檢測(cè);選取具有6個(gè)HMW-GS的籽粒進(jìn)行發(fā)苗移栽獲得F9代植株,再自交,收獲F9代植株上產(chǎn)生的F10代籽粒,再隨機(jī)選取8粒按同樣方法進(jìn)行SDS-PAGE分析,對(duì)HMW谷蛋白亞基進(jìn)行檢測(cè);然后再對(duì)HMW谷蛋白亞基譜帶數(shù)均為6條,且電泳遷移率一致,并含有父本野生二粒小麥Glu-A1Glu-B1位點(diǎn)y-型亞基的上述8粒籽粒,進(jìn)一步按步驟A所述方法進(jìn)行染色體數(shù)目均為2n=42的根尖染色體數(shù)目檢測(cè);

E、將步驟D選取的雜種F10代種子,同時(shí)與母本及父本的種子進(jìn)行室內(nèi)發(fā)芽,剪取幼嫩葉片提取基因組DNA,然后對(duì)HMW-GS編碼基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,選取1Ay的條帶進(jìn)行轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性檢測(cè)、測(cè)序和序列比較分析;

F、將步驟E獲得的F10代種子與母本及父本的核苷酸及其氨基酸序列進(jìn)行比較分析,確認(rèn)雜種育成小麥的Glu-A1位點(diǎn)活性y型亞基編碼基因與父本野生二粒小麥的Glu-A1位點(diǎn)活性y型亞基編碼基因序列高度一致,均具有1830bp的核苷酸長(zhǎng)度,都沒有缺失/插入?yún)^(qū)段,都能編碼608個(gè)氨基酸殘基,且沒有提前終止密碼子,均屬于活性態(tài)的Ay基因;而母本普通小麥Ay等位基因的核苷酸序列短于父本和育成小麥,為1791bp,而且其DNA分子結(jié)構(gòu)上存在著3個(gè)區(qū)段的缺失,其中間重復(fù)區(qū)還存在1個(gè)提前終止密碼子,處于沉默態(tài),由此而確定野生二粒小麥Glu-A1位點(diǎn)的活性y型亞基編碼基因已真實(shí)導(dǎo)入普通小麥基因組;

G、對(duì)步驟F鑒定的雜種后代中的活性Ay等位基因進(jìn)行染色體工程遺傳重組特性分析,確認(rèn)育成普通小麥所擁有的活性Ay基因的DNA序列,在保持父本98.9%的1Ay基因核苷酸的同時(shí),還存在21個(gè)單核苷酸的變異,其中14個(gè)位點(diǎn)為突變,7個(gè)位點(diǎn)為整合了母本普通小麥的核苷酸;

H、對(duì)經(jīng)步驟G確定的育成普通小麥的1Ay基因的編碼亞基活性進(jìn)行異源表達(dá)分析,以證明育成普通小麥所擁有的1Ay?基因與父本野生二粒小麥的1Ay基因一樣具有編碼1Ay亞基的功能;

I、將經(jīng)步驟D-H鑒定后獲選的雜種種子的具有種胚的半粒進(jìn)行培養(yǎng)皿內(nèi)發(fā)芽移栽,再連續(xù)自交2代獲得F11和F12代;繼續(xù)對(duì)F11和F12代的籽粒按步驟A的SDS-PAGE方法進(jìn)行HMW-GS檢測(cè),以進(jìn)一步證明其擁有的6個(gè)HMW-GS能在普通小麥遺傳背景中穩(wěn)定傳遞。

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