[發(fā)明專利]一種可簡易檢測自然水樣中多種赤潮藻的試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310022461.4
• 申請日: 2013-01-21
• 公開（公告）號: CN103045753A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張春云;陳國福;馬超帥
• 申請（專利權(quán)）人: 哈爾濱工業(yè)大學(xué)（威海）
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種可簡易檢測自然水樣中多種赤潮藻的試劑盒，其特征在于，包括膜分類基因芯片條，含檢測赤潮異灣藻、東海原甲藻、新月菱形藻、共生甲藻、中肋骨條藻、柔弱角毛藻、三葉原甲藻、塔瑪亞歷山大藻共8種赤潮藻的種特異性探針、陰性對照探針和陽性對照探針，每條探針2個(gè)重復(fù)；

核酸制備所需試劑：

自然樣品核酸粗提試劑：2%(m/v)CTAB,0.5%(v/v)β-mercaptoethanol,1.4M?NaCl,20mM?EDTA,100mM?Tris-Cl,10U?RNase?Inhibitor；

5×NASBA?Buffer：0.2M?Tris-HCl,60mM?MgCl2,0.35M?KCl2,25mM?DTT,20mM?dNTP；

NTP：10mM?ATP,10mM?GTP,10mM?CTP，6.5mM?UTP,3.5mMDigoxigenin-11-UTP；

5×Primer?mix：75%DMSO,1μM?NASBA-P1,1μM?NASBA-P2,25mM?DTT,20mM?dNTP；

4×Enzyme?mix：1.5M山梨醇,0.42mg/ml?BSA,16U/ml?RNase?H,6400U/ml?T7RNA?Polymerase,1280U/ml?RT-M-MLV，4000U/ml?RNA?inhibitor；

核酸雜交所需試劑：

RNA變性劑：1.5M?NaCl，0.15M二水檸檬酸三鈉，pH7.0,0.15M甲醛；

雜交液：1%Blocking?Reagent?II，0.75M?NaCl,0.075M二水檸檬酸三鈉，50μg/ml鮭精DNA；

Buffer?II：1%Blocking?Reagent?II,0.1M?Tris,0.15NaCl,pH7.5；

堿性磷酸酶標(biāo)記的DIG抗體：AP-抗DIG；

20×SSC：3M?NaCl，0.3M二水檸檬酸三鈉，pH7.0；

10×Buffer?I：1.0M?Tris,1.5M?NaCl,pH7.5；

10×Buffer?III：1.0M?Tris,1.0M?NaCl,0.5M?MgCl₂,pH9.5；

10%SDS；

顯色劑：2.81%NBT，2.19%BCIP，70%二甲基甲酰胺。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述膜分類基因芯片條的制備方法為：

（1）按下表序列信息：

探針信息

（2）將合成的探針干粉溶解于0.1M?Tris-HCl(pH7.5)，配制成濃度為10μM的溶液；

（3）隔著襯紙?jiān)谀猃埬ど嫌密涖U筆劃格,每格大小為5×5mm²,其總大小為0.25cm²，沿總框線將所用的尼龍膜剪下，在尼龍膜第一格的左上角用軟鉛筆點(diǎn)上點(diǎn)標(biāo)記；

（4）將尼龍膜飄浮于雙蒸水表面,讓其吸水后沉入水中，再撈出浸泡于20×SSC中5min，再將膜放置于濾紙上晾干；

（5）探針點(diǎn)膜及固定：將配制的探針溶液用毛細(xì)吸管或移液器在上述處理過的尼龍膜上點(diǎn)樣0.5~1μl，自然晾干；將點(diǎn)樣后的尼龍膜夾于兩層濾紙中間，在80°C烘箱內(nèi)處理2h。