[發(fā)明專利]一種表達豬microRNA-378的方法及專用DNA片段

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310022086.3
• 申請日: 2013-01-21
• 公開（公告）號: CN103045598A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鞠輝明;楊躍飛;白立景;姜星
• 申請（專利權(quán)）人: 揚州大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/63;C12N5/10
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種控制表達豬microRNA-378表達的方法及專用DNA片段。

背景技術(shù)

microRNA（miRNA）是一種短的、含有22個核苷酸的非編碼RNA，他們可以通過與靶基因的序列完全或不完全的配對來調(diào)控基因的表達，動物成熟的miRNA來源于長為80個核苷酸、具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)RNA的一個臂上。miRNA可以調(diào)控細胞的增殖、凋亡、脂肪的代謝、神經(jīng)類型、造血細胞的分化以及植物葉與花地發(fā)育。miRNA可能與增生類的疾病密切相關(guān)，事實上在人類基因組中有很多的miRNA都與常見的腫瘤及癌癥有關(guān)。大量研究表明，miRNA影響分化及細胞周期，同時影響肌肉的發(fā)育。

microRNA-378是近年來發(fā)現(xiàn)的一個可增加細胞的活力，促進腫瘤的生成過表達可以促進成骨細胞的分化及骨節(jié)的形成，對于細胞的增殖與分化有著重要的調(diào)節(jié)作用的mcroRNA。其對動物機體的影響還有待于進一步的研究。人們在深入了解生物基因調(diào)控機制的基礎(chǔ)上，構(gòu)建出一系列可調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達的系統(tǒng)，使所轉(zhuǎn)基因可按研究者的意愿以時空特異的方式進行表達。目前存在的調(diào)控系統(tǒng)很多,其中研究較多、應(yīng)用最為廣泛的是四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)(簡稱tet調(diào)控系統(tǒng))；用tet調(diào)控系統(tǒng)表達基因是近年來常規(guī)調(diào)控手段，但該系統(tǒng)能否調(diào)控microRNA表達不能預(yù)測，特別是對具體的microRNA-378表達能否進行有效調(diào)控更是有待研究。

將該系統(tǒng)通過添加誘導(dǎo)底物實現(xiàn)外源基因的可控表達。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決microRNA-378的表達問題，本發(fā)明提供用于表達microRNA-378的前體片段、表達載體，及表達豬microRNA-378的方法。

一種用于表達microRNA-378的前體片段，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

一種控制表達豬microRNA-378在豬胎兒成纖維細胞中表達的方法。

本發(fā)明提供的增強豬microRNA-378表達量的方法，是將含有上述microRNA-378的前體片段的重組載體導(dǎo)入宿主細胞中，富集具有誘導(dǎo)表達活性的細胞集落群，經(jīng)誘導(dǎo)底物誘導(dǎo)，目的基因的表達量顯著高于誘導(dǎo)前。

具體步驟是：（1）將SEQ?ID?NO.1所示片段插入pSingle-tTS載體的XhoI位點得到重組載體pSingle-tTS-microRNA-378；（2）將重組載體pSingle-tTS-microRNA-378轉(zhuǎn)化到宿主細胞中，用強力霉素(deoxycycline,DOX)誘導(dǎo)表達。

上述microRNA-378的前體片段中含有microRNA-378前體基因。

含有上述microRNA-378的前體片段的重組載體也屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

具體地，所述重組載體是將上述的microRNA-378前體DNA片段插入pSingle-tTS載體的XhoI位點成的重組表達載體pSingle-tTS-microRNA-378。

含有上述microRNA-378的前體片段轉(zhuǎn)基因細胞系也屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

上述轉(zhuǎn)基因細胞是將上述SEQ?ID?NO.1片段導(dǎo)入真核細胞中構(gòu)成的轉(zhuǎn)基因細胞。

進一步，SEQ?ID?NO.1的DNA片段是通過上述的重組載體導(dǎo)入所述真核細胞中的。

上述真核細胞可以是豬胎兒成纖維細胞。

含有上述SEQ?ID?NO.1所示DNA片段的表達盒或重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

實驗證明：和正常組細胞內(nèi)microRNA-378表達相比，pSingle-tTS-microRNA-378細胞組誘導(dǎo)前、后表達效率分別是正常細胞組的7.132倍及318.653倍；而對照組轉(zhuǎn)pSingle-tTS誘導(dǎo)前、后表達效率分別是正常細胞組的3.473及2.210倍，pSingle-tTS-microRNA-378細胞組經(jīng)誘導(dǎo)底物誘導(dǎo)后microRNA-378表達效率顯著提高。

說明構(gòu)建的可控表達microRNA-378載體在豬PEF細胞中具有很高的表達效率及誘導(dǎo)表達活性。

附圖說明

圖1：PCR擴增豬microRNA-378前體DNA產(chǎn)物電泳圖，M是marker，1是豬microRNA-378前體DNA。

圖2：含有microRNA-378前體DNA的真核可控表達載體示意圖