[發(fā)明專利]從臍帶中分離培養(yǎng)間充質干細胞的高效方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310020489.4
• 申請日: 2013-01-21
• 公開（公告）號: CN103266081A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發(fā)明（設計）人: 陳虎;張斌;陳曉穎;盛宏霞;徐曼
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院;鉑生卓越生物科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 程泳

1.一種分離培養(yǎng)間充質干細胞的方法，其包括以下的步驟（1），以及步驟（2）和步驟（3）中的一項或兩項：

（1）取離體的臍帶用組織消化酶進行消化處理；優(yōu)選地，在消化處理前還包括將臍帶分割成小段臍帶組織塊的步驟；

（2）在步驟（1）的消化處理結束后，取細胞懸液置于間充質干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到間充質干細胞；優(yōu)選地，在培養(yǎng)過程中，將換液時所換下的細胞懸液重置于新培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，得到間充質干細胞；

優(yōu)選地，在將步驟（1）處理后得到的細胞懸液置于間充質干細胞培養(yǎng)基前還包括將細胞懸液離心的步驟，將離心后得到的細胞沉淀置于間充質干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

任選地，在得到間充質干細胞后，還包括將細胞消化傳代的步驟；

（3）在步驟（1）的消化處理結束后，取未完全消化的臍帶組織置于間充質干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可得到間充質干細胞；任選地，在得到間充質干細胞后，剩余的臍帶組織通過多次重復本步驟中的方法，可多次得到間充質干細胞；任選地，在得到間充質干細胞后，還包括將細胞消化傳代的步驟。

2.權利要求1的方法，其中所述的組織消化酶為膠原酶和/或透明質酸酶。

3.權利要求1的方法，其中所述的將臍帶分割成小段臍帶組織塊之前，還包括去除臍動脈的步驟；任選地，在去除臍動脈之前，還包括清洗離體的臍帶的步驟。

4.權利要求2的方法，其中所述的膠原酶的工作濃度為0.05-0.2%重量體積；和/或其中所述的透明質酸酶的工作濃度為0.0005-0.001%重量體積。

5.權利要求1的方法，其中步驟（1）中所述的消化處理的條件是37℃，1-3h。

6.權利要求1的方法，其中所述的間充質干細胞培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。

7.權利要求1的方法，其中步驟（2）中所述的將細胞懸液置于間充質干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，是指待細胞貼壁生長后，培養(yǎng)至80-90%細胞融合。

8.權利要求1的方法，其中步驟（3）中所述的取未完全消化的臍帶組織置于間充質干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，是指待組織塊周圍有梭形細胞爬出后，培養(yǎng)至80-90%細胞融合。

9.權利要求1的方法，其中所述的消化傳代包括使用胰酶-EDTA溶液的步驟；優(yōu)選地，所述的消化傳代方法包括：

（i）用生理鹽水洗滌細胞；

（ii）加入適量胰酶-EDTA溶液，待溶液鋪平細胞培養(yǎng)瓶底面后吸棄胰酶-EDTA溶液；

（iii）用原液吹打細胞，制成單細胞懸液，計數(shù)后接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

10.根據(jù)權利要求1-9任一項所述的方法制備得到的間充質干細胞。

11.權利要求10的間充質干細胞，其表達CD90、CD105、CD73，不表達CD31、CD14、CD34、CD45、CD80、CD86、CD40、CD40L和HLA-DR。

12.膠原酶和/或透明質酸酶用于制備間充質干細胞的用途。