[發(fā)明專利]一種鯉皰疹病毒2型LAMP檢測試劑盒及檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310019403.6
• 申請日: 2013-01-18
• 公開（公告）號: CN103045764A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曾令兵;范玉頂;張輝;周勇;徐進
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于魚類病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鯉皰疹病毒2型LAMP檢測試劑盒，還涉及一種利用鯉皰疹病毒2型LAMP檢測試劑盒檢測鯉皰疹病毒2型的方法。

背景技術(shù)

在我國的鯽魚主養(yǎng)區(qū)，2009年零星發(fā)生鯽魚病毒性出血病，發(fā)病情況出現(xiàn)逐年上升的趨勢，死亡率高，目前尚未有有效的控制措施，初步研究表明其病原為鯉皰疹病毒Ⅱ型（Cyprinid?herpesvirus?II,CyHV-2），初步命名該病為鯽造血器官壞死癥（Crucian?Carp?Hematopoietic?Necrosis）。2011年在匈牙利養(yǎng)殖的銀鯽也發(fā)現(xiàn)了CyHV-2感染的病例。

CyHV-2在幾種魚類細胞系中的增殖均不能超過4代，需要盡快建立快速、敏感、特異、適宜現(xiàn)場診斷的方法，為疾病的診斷與防控提供技術(shù)手段，也為鯽魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)保障。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loop-mediated?isothermal?amplification,LAMP)技術(shù)是Notomi等于2000年報道的一種新型等溫核酸擴增方法（國際專利公開號WO00/28082），針對靶基因的6個位點設(shè)計4條LAMP引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst?DNA聚合酶)，在恒溫條件下快速、高效、高特異、高靈敏地擴增靶序列，適合于現(xiàn)場和實驗條件較簡單的實驗室進行快捷檢測。引入一對環(huán)狀引物的改進方法，進一步縮短了反應(yīng)時間。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是在于提供了一種鯉皰疹病毒2型LAMP檢測試劑盒，根據(jù)GenBank公布的CyHV-2毒株的解旋酶基因編碼區(qū)序列(KC245087)，應(yīng)用PrimerExplorer?V4?（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）在線軟件設(shè)計特異性引物，利用LAMP技術(shù)擴增靶基因的特定區(qū)域，從分子水平對鯉皰疹病毒2型進行快速檢測，具有簡便、快速、高特異性和靈敏性的特點。

本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種利用鯉皰疹病毒2型LAMP檢測試劑盒檢測鯉皰疹病毒2型的方法，本方法僅需一個水浴鍋或金屬浴即可在2小時內(nèi)準(zhǔn)確檢測出樣品中的CyHV-2，能檢測CyHV-2感染的病魚組織，能檢測CyHV-2感染的細胞（例如Koi-Fin細胞），非常適用于CyHV-2的現(xiàn)場快速檢測。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種鯉皰疹病毒2型LAMP檢測試劑盒，包括以下成分：

該試劑盒包括以下成分：10×ThermoPol?Reaction?Buffer；Bst?DNA聚合酶（NEB）；dNTPs；外引物F3和B3、內(nèi)引物FIP和BIP、Betaine（Sigma），MgCl₂，1000×SYBR?Green?I（Invitrogen）。

F3：5’-TTGGATCTGAACGCTTCGG-3’；

B3：5’-CGTTGGTCTGTATGGGAGC-3’；

FIP：5’-GCGATGTAAGCCCTGTGAGACTTTTTACGAGACGTGGTTCCTAGC-3’；

BIP：5’-AACGCACGAGTGCGAGTCTCTTTTGCTGTGGATCGTCCATCC-3’。

一種利用鯉皰疹病毒2型LAMP檢測試劑盒檢測鯉皰疹病毒2型的方法，其步驟是：

1、病毒DNA的獲取：

采用試劑或Viral?DNA?Kit試劑盒等提取樣本總DNA模板，DNA在95℃5分鐘后迅速置于冰浴中的預(yù)處理可以增加檢測的靈敏度。

2、LAMP擴增：

采用25μl反應(yīng)體系，包括：內(nèi)引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，MgCl₂2-10mM，Bst?DNA聚合酶8U，模板DNA5μl，10×ThermoPol?Reaction?Buffer2.5μl，去離子水補足余量。選擇55-65℃的溫度范圍和30-120分鐘的時間范圍進行LAMP反應(yīng)之后，80℃滅活2分鐘。

3、檢測結(jié)果判定，可用下述三種方法之一進行結(jié)果的判定：

1）發(fā)生擴增反應(yīng)時，從dNTPs析出的焦磷酸根離子和反應(yīng)液中的鎂離子形成白色焦磷酸鎂沉淀，通過肉眼判斷：檢測管出現(xiàn)明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性。