[發(fā)明專利]膠原/纖維蛋白膠-VEGF與間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建的雙層皮膚覆蓋物及制備方法和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310018866.0
• 申請日: 2013-01-18
• 公開（公告）號(hào): CN103041453A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳紅麗;南文濱;張慧;李永海;劉涌濤;劉瑞;林俊堂;豐慧根
• 申請（專利權(quán)）人: 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): A61L27/60
• 分類號(hào): A61L27/60;A61L27/24;A61L27/22
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合UCMSCs雙層皮膚覆蓋物，其特征在于該雙層皮膚覆蓋物包括膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架和UCMSCs的活性層，其中VEGF分布在纖維蛋白膠層，兩層具有不同的孔隙率。

2.權(quán)利要求1所述膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合UCMSCs雙層皮膚覆蓋物，其中膠原層孔隙直徑為（130.0±24.5）μm，膠原層厚度為（0.18±0.045）cm，膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架材料厚度為（0.25±0.095）cm。

3.權(quán)利要求1所述膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合UCMSCs雙層皮膚覆蓋物，其中膠原層孔隙率為（74.8±10.8）%，膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架的孔隙率為（64.5±6.9）%。

4.權(quán)利要求1所述的膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合UCMSCs雙層皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于包括膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架的制備，步驟如下：

（1）膠原溶脹液與丙二酸溶液配制質(zhì)量濃度為0.3%~1.0%的膠原溶液，攪拌均勻后注入不銹鋼模具，預(yù)凍后冷凍干燥得到膠原海綿狀固體；

（2）將上述膠原海綿狀固體浸入戊二醛溶液進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，清洗后再次進(jìn)行冷凍干燥制備得到膠原多孔支架；

（3）將膠原多孔支架裝入聚乙烯薄膜小袋中，封口后γ射線⁶⁰Co，2×10⁶rad輻射滅菌；

（4）將VEGF的PBS溶液與纖維蛋白原混合成含VEGF?1mg/ml后，加入凝血酶，制備纖維蛋白膠；

（5）將上述纖維蛋白膠迅速加入膠原支架層，靜置20分鐘形成膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合UCMSCs雙層皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架的制備步驟（1）中膠原溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為0.3%，0.6%，0.9%。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合UCMSCs雙層皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架的制備步驟（2）中化學(xué)交聯(lián)的條件優(yōu)選為戊二醛溶液體積百分比0.3%，?20℃，12小時(shí)。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合UCMSCs雙層皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架的制備步驟（5）中的纖維蛋白膠加入膠原支架的量為0.2ml/cm²-1.0?ml/cm²，加入時(shí)間控制為1.0-2.0秒。

8.權(quán)利要求4所述的膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合UCMSCs雙層皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于還包括膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架復(fù)合UCMSCs的制備，步驟如下：

（1）分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，?用DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)至第三代對(duì)數(shù)期，離心收集細(xì)胞；

（2）加入培養(yǎng)基制成細(xì)胞密度為5.0×10⁵個(gè)/ml~5.0×10⁷個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，滴加到膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架的纖維蛋白-VEGF層，加入細(xì)胞懸液的量為0.1ml/cm²-1.0?ml/cm²；

（3）加入培養(yǎng)基浸沒膠原層，置于37℃、5％CO₂飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中孵育0.5~4小時(shí)。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合UCMSCs雙層皮膚覆蓋物在構(gòu)建組織工程皮膚中的應(yīng)用。