[發(fā)明專利]可同時檢測副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌和溶藻弧菌的多重PCR檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310017980.1
• 申請日: 2013-01-18
• 公開（公告）號: CN103103266A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李華;李強(qiáng);馮春明;葉仕根;王軼南
• 申請（專利權(quán)）人: 大連海洋大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 大連非凡專利事務(wù)所 21220
• 代理人: 閃紅霞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種多重PCR檢測方法，尤其是一種耗時短、效率高、靈敏度高，可直接應(yīng)用于臨床的可同時檢測副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌和溶藻弧菌的多重PCR檢測方法。

背景技術(shù)

弧菌廣泛分布于近岸、河口海區(qū)，大多是存在于海水和海洋生物體表及腸道的優(yōu)勢菌群，同時也是引起海水養(yǎng)殖動物細(xì)菌性疾病的最重要的病原菌之一。大量的研究和生產(chǎn)實踐表明，弧菌病就是由弧菌屬細(xì)菌引起的一類細(xì)菌性疾病，流行廣、發(fā)病率高，主要的病原弧菌有：溶藻弧菌(Vibrio?alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio?parahaemolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio?vulnificus)等10多種弧菌。

溶藻弧菌可導(dǎo)致對蝦敗血癥；導(dǎo)致黑鯛表皮潰瘍、出血、有黑斑，眼球突出、充血，腹部腫脹，肝臟充血，腎臟蒼白，脾臟腫大等；導(dǎo)致點帶石斑魚體表有潰瘍，鰓、鰭等充血，腹腔積液，肝嚴(yán)重腫大，腎、脾等臟器毛細(xì)血管充血等。溶藻弧菌感染的宿主范圍還十分廣泛，可以通過生食被感染的貝類、魚類等傳染給人類，是沿海地區(qū)食物中毒和腹瀉的重要病原菌，食物中毒患者可出現(xiàn)腹瀉、腹部痙攣、惡心、嘔吐、發(fā)熱，甚至脫水、昏迷等癥狀。

創(chuàng)傷弧菌可感染黃姑魚、青石斑、鮭點石斑、紅鰭笛鯛、鰻鱺等養(yǎng)殖動物，主要癥狀為患病魚體表有出血點甚至潰爛，各鰭基部充血、出血、發(fā)炎。創(chuàng)傷弧菌也是引起人畜共患病的重要病原菌，該病主要引起原發(fā)性敗血癥和嚴(yán)重的創(chuàng)傷口感染，也可以導(dǎo)致壞死性腸胃炎、腦膜炎、肺炎、角膜炎等病，死亡率超過50%。

副溶血弧菌可引起凡納濱對蝦幼蝦（體長2~3cm）發(fā)生毀滅性死亡，主要癥狀為運動能力差，攝食能力下降，身體彎曲，體表和附肢上常有大量污物附著，肌肉渾濁、鰓部呈黑色等癥狀；感染紅鰭笛鯛引起的潰瘍病、傳染性強(qiáng)，患病紅鰭笛鯛的癥狀表現(xiàn)為：體色變淺，胸鰭、尾鰭、腹鰭潰爛，體表潰瘍且黏液增多，潰瘍周圍的鱗片大面積脫落。

目前，多重PCR主要應(yīng)用于可引起人類疾病的弧菌檢測，如食品檢測等，而在水產(chǎn)動物弧菌病基本上都是沿用普通PCR方法，一次只能檢測一種弧菌，檢測所需時間長且常常造成漏檢或誤檢。

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的PCR方法檢測水產(chǎn)動物弧菌病致病菌，一次只能檢測一種弧菌，檢測所需時間長，且常常造成漏檢現(xiàn)象的問題，提供一種可以同時檢測多種弧菌病致病菌檢測的多重PCR方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在上述問題，提供一種耗時短、效率高、靈敏度高，可直接應(yīng)用于臨床的可同時檢測副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌和溶藻弧菌的多重PCR檢測方法。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種可同時檢測副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌和溶藻弧菌的多重PCR檢測方法，其特征在于依次按如下步驟進(jìn)行：

a.?制備被檢測物的DNA模板并置于反應(yīng)管中；

b.?將副溶血弧菌、溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌引物放入a步驟的反應(yīng)管中進(jìn)行多重PCR?反應(yīng)，所述副溶血弧菌引物濃度為1~20?pmol/μl，所述創(chuàng)傷弧菌引物濃度為1~20?pmol/μl，所述溶藻弧菌引物濃度為1~30?pmol/μl；

所述副溶血弧菌的引物序列為：

flaE-F:5’-?GCAGCTGATCAAAACGTTGAGT-3’

flaE-R:?5’-ATTATCGATCGTGCCACTCAC-3’

所述創(chuàng)傷弧菌的引物序列為：

?vvh-F:?5’-TTCCAACTTCAAACCGAACTATGAC-3’

?vvh-R:?5’-ATTCCAGTCGATGCGAATACGTTG-3’

所述溶藻弧菌的引物序列為：

?col-F：5’-CGAGTACAGTCACTTGAAAGCC-3’

?col-R：5’-CACAACAGAACTCGCGTTACC-3’

?所述多重PCR?反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃?30s，52.0-61℃?30s，72℃?1min，共32個循環(huán)；72℃終延伸7min；

?所述多重PCR反應(yīng)體系為25μl：1μlDNA模板，2.5μl不含Mg²⁺的10×PCR?buffer，0.5μl的10mM的dNTP，2μl的25mM的Mg²⁺，0.15μl的Taq酶（50U），引物各1μl，雙蒸水17.85μl。