[發明專利]一種熒光免疫層析流感病毒檢測試紙

無效

• 申請號: 201310017612.7
• 申請日: 2013-01-17
• 公開（公告）號: CN103105492A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 魏啓明
• 申請（專利權）人: 重慶市科學技術研究院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所 50211
• 代理人: 郭云

1.一種熒光免疫層析流感病毒檢測試紙，包括PVC底板(1)，在PVC底板(1)上表面鋪有結合墊(3)，在結合墊(3)的左邊設置加樣孔(2)，右邊依次粘貼硝酸纖維膜(4)和吸水墊(9)，所述硝酸纖維膜(4)上從左到右依次設有線狀或帶狀的三條檢測抗體檢測線和β-肌動蛋白檢測抗體控制線(8)，其特征在于：所述結合墊(3)由玻璃纖維膜組成，在玻璃纖維膜上均勻附著有紅色、綠色和橙色的熒光素顆粒，其中紅色熒光素顆粒上分別偶聯三種抗目的物檢測抗體，綠色熒光素顆粒上偶聯AMACR抗原，橙色熒光素顆粒上偶聯抗β-肌動蛋白抗體作為內參。

2.根據權利要求1所述的一種熒光免疫層析流感病毒檢測試紙，其特征在于：所述熒光素顆粒選自異硫氰酸熒光素或四甲基異硫氰酸羅丹明或四乙基羅丹明。

3.根據權利要求1或2所述的一種熒光免疫層析流感病毒檢測試紙，其特征在于：所述三條檢測抗體檢測線為普通流感病毒檢測抗體檢測線(5)、禽流感病毒檢測抗體檢測線(6)、甲型流感病毒檢測抗體檢測線(7)，所述三種抗目的物抗體為普通流感病毒檢測抗體、禽流感病毒檢測抗體和甲型流感病毒檢測抗體。

4.根據權利要求3所述的一種熒光免疫層析流感病毒檢測試紙，其特征在于：所述PVC底板(1)為長為10cm、寬為4cm的矩形聚乙烯塑料片，所述硝酸纖維膜(4)為長為8cm、寬為3cm、厚度為0.1mm、平均孔徑為5um的微多孔硝酸纖維素膜片。

5.根據權利要求3所述的一種熒光免疫層析流感病毒檢測試紙，其特征在于：三條抗體檢測線按照如下方法制得：

用磷酸鹽緩沖液分別稀釋3種流感病毒的多克隆抗體，即普通流感病毒多克隆抗體、禽流感病毒多克隆抗體和甲型流感病毒多克隆抗體，使溶液中多克隆抗體重量百分比濃度為0.05-0.3mg/ml，制得普通流感病毒多克隆抗體溶液、禽流感病毒多克隆抗體溶液和甲型流感病毒多克隆抗體溶液；然后用點膜器將上述普通流感病毒多克隆抗體溶液、禽流感病毒多克隆抗體溶液和甲型流感病毒多克隆抗體溶液以3μL/cm分別在硝酸纖維膜(4)上依次點成線狀或帶狀的普通流感病毒檢測抗體檢測線(5)、禽流感病毒檢測抗體檢測線(6)和甲型流感病毒檢測抗體檢測線(7)。

6.根據權利要求3所述的一種熒光免疫層析流感病毒檢測試紙，其特征在于：所述結合墊(3)按照如下步驟制得：

1)熒光素顆粒的表面硅化：分別在5-10ml乙醇中，加入0.1-10mg紅、綠、橙三種顏色的熒光素顆粒、1-10uL?N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷，在15-50℃恒溫攪拌3-10小時，再依次加入0.1-10mL水、0.1-10mL15％wt氨水、0.1-10mL正硅酸乙酯(TEOS)，繼續反應3-10小時，然后用乙醇洗滌獲得紅、綠、橙三種顏色的表面硅化的熒光素顆粒；

2)熒光素顆粒的表面氨基化：取上述表面硅化的熒光素顆粒，加入10-50mL1：3-3：1(VN)甲醇和丙三醇組成的混合溶液，超聲分散，然后加入10-500uL?N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷，在15-50℃恒溫攪拌5-10小時，用乙醇洗滌，干燥，獲得表面氨基化的熒光素顆粒；

3)熒光素顆粒表面連接抗體：將上述表面氨基化的紅色熒光素顆粒分散在5-10ml磷酸緩沖液中，加入5-10ml戊二醛反應2-5小時，離心除去戊二醛，將紅色熒光素顆粒重新分散在5-10ml磷酸緩沖液中，加入普通流感病毒檢測抗體、禽流感病毒檢測抗體和甲型流感病毒檢測抗體，使得各種抗體的濃度分別為100ug/ml，室溫攪拌反應1-5小時，用磷酸緩沖液洗滌后獲得熒光素顆粒-抗體復合物，然后將熒光素顆粒-抗體復合物保存在含0.1％BSA和0.1％Tween20的磷酸緩沖液中；

將上述表面氨基化的綠色熒光素顆粒分散在5-10ml磷酸緩沖液中，加入5-10ml戊二醛反應2-5小時，離心除去戊二醛，將綠色熒光素顆粒重新分散在5-10ml磷酸緩沖液中，加入AMACR抗原，使得AMACR抗原濃度為100ug/ml，室溫攪拌反應1-5小時，用磷酸緩沖液洗滌后獲得熒光素顆粒-AMACR抗原復合物，然后將熒光素顆粒-AMACR抗原復合物保存在含0.1％BSA和0.1％Tween20的磷酸緩沖液中；

將上述表面氨基化的橙色熒光素顆粒分散在5-10ml磷酸緩沖液中，加入5-10ml戊二醛反應2-5小時，離心除去戊二醛，將橙色熒光素顆粒重新分散在5-10ml磷酸緩沖液中，加入β-肌動蛋白抗體，使得β-肌動蛋白抗體濃度為100ug/ml，室溫攪拌反應1-5小時，用磷酸緩沖液洗滌后獲得熒光素顆粒-β-肌動蛋白抗體復合物，然后將熒光素顆粒-β-肌動蛋白抗體復合物保存在含0.1％BSA和0.1％Tween20的磷酸緩沖液中；

最后將紅、綠、橙三種復合熒光素顆粒表面沒有完全反應的活化基團進行封閉，以降低在以后試驗中可能發生的非特異性吸附；再將紅、綠橙三種復合熒光素顆粒重懸在保護液中，制成濃度為2mg/ml的微球溶液進行保存，其中保存液為pH9.0，含0.05％Tween-20，0.1％NaN₃和0.1％BSA的0.005M硼酸鹽緩沖液；最后將紅，綠和橙三種復合熒光素顆粒等質量混合制成一種紅綠橙三色混合免疫復合熒光素顆粒；用移液槍將10-40微升，濃度為2mg/ml的復合熒光素顆粒均勻滴在玻璃纖維膜上，然后干燥得到結合墊(3)。