[發明專利]一種誘導成熟細胞去分化的方法

有效

• 申請號: 201310017486.5
• 申請日: 2013-01-17
• 公開（公告）號: CN103087981A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 蘇冠男;趙燕南;魏建樹;陳冰;肖志峰;戴建武
• 申請（專利權）人: 中國科學院遺傳與發育生物學研究所
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12N5/073
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種誘導成熟細胞去分化的方法。

背景技術

去分化是指將已分化的細胞類型轉化為另一較原始的具備更多分化潛能的細胞類型，如類似胚胎干細胞或前體細胞的狀態。去分化的研究對于細胞生物學的科學研究和干細胞的臨床應用方面都具有重要意義。目前去分化研究主要采取轉基因的方法，但是由于基因組的改變，細胞面臨癌變的風險。細胞命運不僅受內部基因的調控，外部環境的影響也是很關鍵的，如能通過物理手段調控細胞微環境實現細胞去分化將避免轉基因去分化所帶來的細胞癌變風險。

發明內容

本發明的目的是提供一種誘導成熟細胞去分化的方法。

本發明提供的方法，包括如下步驟：將成熟細胞在哺乳動物細胞固體培養基中進行培養，得到球狀細胞，實現誘導成熟細胞去分化；

所述哺乳動物細胞固體培養基為將哺乳動物細胞液體培養基與凝固劑混合，得到固體培養基。

上述方法中，所述哺乳動物細胞液體培養基可以根據培養的細胞不同進行選擇，本發明培養HEK293細胞，因此選用的哺乳動物細胞液體培養基為2×DMEM基礎液體培養基；

所述凝固劑為瓊脂糖；凝固劑的加入量只要凝固即可，本發明的實施例為等體積的2×DMEM基礎培養基和1%瓊脂糖溶液混勻。

所述瓊脂糖為質量百分含量為1%瓊脂糖水溶液；

所述2×DMEM基礎液體培養基與質量百分含量為1%瓊脂糖水溶液混合體積比為1:1。

上述方法中，所述培養為將所述成熟細胞接種到裝有所述哺乳動物細胞固體培養基的培養容器上進行培養；

所述培養的條件如下：在37℃、5%CO₂培養。

上述方法中，所述培養的時間為5-10天；

所述培養容器為培養皿；

所述成熟細胞與所述固體培養基的配比為10⁶-6×10⁶個/5ml。

上述方法中，所述成熟細胞為HEK293細胞。

上述方法中，所述球狀細胞具有胚胎干細胞全能性，但不是人胚胎干細胞；所述胚胎干細胞全能性具體體現在如下1)-5)中至少一種：

1）提高iPS重編程轉錄因子的相對表達量；

所述iPS重編程轉錄因子具體為OCT4、NANOG、SOX2、KLF4和/或LIN28；

2）提高胚胎干細胞標志物的相對表達量；

所述胚胎干細胞標志物具體為REX1、TDGF1、LEFTB、EBAF、GRB7、PODXL和/或FGF4；

3）提高三胚層標志物的相對表達量；

所述三胚層標志物為內胚層標志物FoxA2、Afp、Sox17和Pdx-1中的至少一種、中胚層標志物Brachyury、Msx1中的至少一種和/或外胚層標志物Nestin、Otx2和Tp63中的至少一種；

4）提高細胞成瘤能力；

5）提高腎臟組織前體標志物相對表達量。

所述腎臟組織前體標志物為PAX2、WT1、INTEGRINa8、SALL1、LIM1、NCAMl、SIX2、FRIZZLED?2、FRIZZLED?7、ACVR2b/或NTRK2。

由上述方法得到的球狀細胞也是本發明保護的范圍。上述球狀細胞具有胚胎干細胞全能性，但不是人胚胎干細胞；所述胚胎干細胞全能性具體體現在如下1)-5)中至少一種：

1）提高iPS重編程轉錄因子的相對表達量；

2）提高胚胎干細胞標志物的相對表達量；

3）提高三胚層標志物的相對表達量；

4）提高細胞成瘤能力；

5）提高腎臟組織前體標志物相對表達量。

本發明的實驗證明，本發明將具有分化功能的HEK293細胞通過低貼附表面的培養方法，人胚胎腎上皮細胞系HEK293以三維立體球狀生長，實驗結果表明三維球狀培養的HEK293細胞發生了去分化，獲得了胚胎干細胞和腎臟前體細胞的特性。

附圖說明

圖1為細胞在二維貼壁培養皿和在低貼附培養皿上培養結果

圖2為細胞在二維培養和低貼附培養后iPS重編程轉錄因子和胚胎干細胞標志物的相對表達量

圖3為細胞在二維培養和低貼附培養后內胚層標志物、中胚層標志物和外胚層標志物的相對表達量

圖4為細胞在二維培養和低貼附培養后致瘤能力

圖5為細胞在二維培養和低貼附培養后腎組織前體細胞標志物的相對表達量

具體實施方式