[發明專利]白樺GA20ox1基因BpGA20ox1及其應用

無效

• 申請號: 201310017361.2
• 申請日: 2013-01-17
• 公開（公告）號: CN103014031A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 魏志剛;張凱旋;楊傳平
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;A01H5/00
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及的是白樺GA20ox1基因BpGA20ox1及其應用。

背景技術

赤霉素（Gibberellins,簡稱GAs）是高等植物整個生命周期中極為重要的生長調節劑，可影響植物整個生命周期中的生長和發育過程，主要包括促進種子發芽、嫩芽和莖的伸長、葉片擴展、毛狀體發育、花和果實發育等過程，而且在樹木木材形成過程中也具有重要作用。GA20氧化酶（GA20ox）是具有生物活性GAs生物合成調控酶，屬于可溶性的雙加氧酶，它能在GAs生物合成的最后階段催化從GA12到GA9及GA53到GA20一系列的氧化反應，經連續氧化失去CO₂的過程，最后形成具有生物活性的GA4和GA1。合成GA20ox功能缺失的突變體具有半矮化的表型，而過量表達GA20氧化酶則能導致赤霉素的過量合成和植株生長速度的明顯加快。因此，GA20-氧化酶是GAs合成過程中關鍵的限速酶。隨著分子生物學的不斷發展，對GA20氧化酶基因的研究是了解赤霉素的作用機理的重要基礎之一。編碼GA20ox的基因在許多植物中已經被克隆并進行深入的表達分析，例如擬南芥、土豆（Solanum?tuberosum）、水稻（Oryza?sativa）、南瓜（Cucurbita?moschata）、向日葵（Helianthus?annuus）、玉米、蘋果（Malus?x?domestica）、棉花（Gossypium?hirsutum）等。如Carrera等人通過遺傳修飾GA20ox基因水平來改變土豆體內的GA含量，研究證實，與對照相比，在轉基因土豆中，GA20ox基因正義轉化可使其植株高度增加、節間增長以及塊莖休眠時間縮短，而反義轉化植株則相反，植物整體的生長和發育模式受到了抑制。

白樺(Betula?platyphylla)為我國東北與內蒙古地區的先鋒樹種，是非常優良的短周期闊用材樹種。目前，對白樺內源激素相關基因的分子機理研究尚無報道。因此，本項研究將通過克隆與分析白樺GA20ox1基因，對其系統分析和研究，為培育出生長速度快、紙漿性狀得到顯著改善的轉GA20ox1基因紙漿用材新品種奠定基礎，這對于通過分子育種手段加速紙漿材林木新品種具有較大意義。

發明內容

為了加速白樺(Betulaplatyphylla)木材分子育種的進程，本研究對對白樺GA20氧化酶基因克隆和功能研究。

本發明的技術方案如下：

白樺GA20ox1基因BpGA20ox1，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：14所示。

所述的白樺GA20ox1基因BpGA20ox1應用，可以應用于紙漿用材林木新品種的育種。

本發明首先克隆并獲得白樺GA20ox1基因。利用已知的與白樺親緣關系較近的幾個物種的GA20ox基因序列，根據保守區設計兼并引物克隆出了白樺GA20氧化酶基因片段，之后利用RACE技術獲得一條1586bp的cDNA序列。經序列比對分析，其與歐洲GA20ox1蛋白的同源性高達99%，將該基因命名為BpGA20ox1基因，該基因全長編碼序列為1164bp，共編碼387個氨基酸，BpGA20ox1蛋白的分子量為44.3kDa，理論等電點為6.5，是2OG-FeII_Oxy基因家族的成員。

然后，本發明利用熒光實時定量PCR研究了BpGA20ox1在頂端分生組織、嫩葉、成熟葉、葉柄、、未成熟木質部、成熟木質部、節間和韌皮部的表達情況，結果發現，BpGA20ox1在成熟木質部中表達豐度最高，在幼嫩葉片中的表達量較高，在未成熟木質部、韌皮部、頂端分生組織和成熟葉中則表達豐度中等，而在葉柄中有少量表達，在節間組織中表達豐度相對最低。

本發明還構建了正義植物表達載體pROK2-GA20ox1，并通過農桿菌介導法將其轉入煙草，對轉化植株的PCR檢測初步證明外源基因已經整合到煙草基因組中。對轉BpGA20ox1基因煙草植株及未轉基因煙草植株的綜纖維素含量和Klason木質素含量測定和分析表明，過表達BpGA20ox1基因的煙草綜纖維素含量和纖維長度比對照組均有不同程度的提高，而Klason木質素含量并無明顯變化。這表明通過基因技術，可培育出生長速度快、紙漿性狀得到顯著改善的轉BpGA20ox1基因的紙漿用材林木新品種，這對于通過分子育種手段加速紙漿材林木新品種培育進程意義重大。

附圖說明

圖1為白樺莖木質部總RNA的電泳檢測。

圖2為BpGA20ox1基因片段PCR擴增產物的電泳檢測。