[發明專利]多通道環介導核酸等溫擴增定量檢測器

無效

• 申請號: 201310017321.8
• 申請日: 2013-01-17
• 公開（公告）號: CN103045469A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 鮑軍波;方雪恩;孔繼烈
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;盛志范

技術領域

本發明屬于核酸等溫擴增技術領域，具體涉及一種用于多通道環介導核酸等溫擴增定量（LAMP）檢測器。

技術背景

常規的病原微生物檢測方法是采用體外培養技術，但是，僅有約1%的細菌或病毒可以培養，以及培養過程的復雜性和漫長的培養時間，大大限制了這樣技術的普及。以聚合酶鏈反應（PCR）為代表的基于核酸的檢測技術發展迅速，為病原體的精確檢測診斷提供了可能。經過幾十年的改進，PCR方法已從定性發展為定量，能夠在幾個小時內，從幾個拷貝或單個細胞開始擴增到數十億特異性的核酸片段，而且特異性也有了極大的提高。然而，從PCR技術的誕生之日起，它始終無法擺脫依賴精良儀器設備的局限，使得以PCR為基礎的核酸擴增檢測技術無法更廣泛地推廣和應用。

基于這種強烈的需求，以核酸等溫擴增技術為基礎的檢測技術近年來得到了迅猛的發展。核酸等溫擴增技術不需要溫度變化的時間過程，擺脫了對精良儀器設備的依賴，使得我們對病原體的檢測診斷得以快速并高通量的實現。Notomi?等于2000?年開發的環介導等溫擴增法(?loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP)?技術，其特點是針對靶基因的6?個區域設計4?條特異引物，并利用一種鏈置換DNA?聚合酶(Bst?DNA?polymerase)?在等溫條件(65?℃左右)?保溫幾十分鐘，即可高效、快速、高特異地完成靶核酸序列的擴增反應。該技術不需要模板的熱變性、長時間溫度循環、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程。LAMP?是一種嶄新的DNA?擴增方法,具有簡單、快速、特異性強的特點，具有替代PCR?方法的可能性。近年來，國外己將該技術廣泛應用于病原體檢測。Masaki?Imai等人(2007)利用LAMP建立了禽流感病毒的實驗室確診體系；Obuyuki?Rayashi等人（2007）針對四種香酒酵母的ITS序列設計了特異性引物，建立了高效的LAMP檢測體系。

LAMP法的原理

DNA在65℃左右處于動態平衡狀態，任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈。上游內部引物FIP的F2序列首先與模板F2c結合，在鏈置換型DNA聚合酶的作用下，以FIP引物F2區段的3'?末端為起點，與模板DNA互補序列配對，啟動鏈置換DNA合成。F3引物與F2c前端F3c序列互補，以3'?末端為起點，通過鏈置換型DNA聚合酶的作用，一邊置換先頭FIP引物合成的DNA鏈。一邊合成自身DNA，如此向前延伸。最終F3引物合成而得的DNA鏈與模板DNA形成雙鏈。由FIP引物先合成的DNA鏈被F3引物進行鏈置換產生一單鏈，這條單鏈在5'?末端存在互補的Flc?和Fl?區段，于是發生自我堿基配對，形成環狀結構。同時，BIP引物同該單鏈雜交結合，以BIP引物的3'??端為起點，合成互補鏈，在此過程中環狀結構被打開。接著，類似于F3，B3引物從BIP引物外側插入，進行堿基配對，以3'?端為起點，在聚合酶的作用下，合成新的互補鏈。通過上述兩過程，形成雙鏈DNA。而被置換的單鏈DNA兩端存在互補序列，自然發生自我堿基配對，形成環狀結構，于是整條鏈呈現啞鈴狀結構。該結構是LAMP法基因擴增循環的起始結構。至此為止的所有過程都是為了形成LAMP法基因擴增循環的起點結構。

在啞鈴狀結構中，以3'?末端的Fl?區段為起點，以自身為模板，進行DNA合成延伸。與此同時，FIP引物F2與環上單鏈F2c雜交，啟動新一輪鏈置換反應。解離由F1區段合成的雙鏈核酸。同樣，在解離出的單鏈核酸上也會形成環狀結構。在環狀結構上存在單鏈形式B2c，BIP引物上的B2與其雜交，啟動新一輪擴增。經過相同的過程，又形成環狀結構。通過此過程，結果在同一條鏈上互補序列周而復始形成大小不一的結構。

該方法主要是利用4種不同的特異性引物識別靶基因的6個特定區域，且可在等溫條件進行擴增反應。基因的擴增和產物的檢測可一步完成，擴增效率高，可在15～60?min擴增10⁹～10¹⁰?倍；特異性高，所有靶基因序列的檢測可只通過擴增產物的有、無來判別。有、無擴增反應是利用熒光定量PCR儀檢測反應的熒光強度或利用核酸擴增過程中產生的焦磷酸鎂沉淀反應，用濁度儀檢測沉淀濁度來判定的。