[發明專利]一種DNA多位點定向突變方法

無效

• 申請號: 201310016659.1
• 申請日: 2013-01-16
• 公開（公告）號: CN103088015A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 趙淑娟;周祿斌;胡之璧;王崢濤;周吉燕
• 申請（專利權）人: 上海中醫藥大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 上海麥其知識產權代理事務所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

1.一種DNA多位點定向突變方法，其特征在于，根據DNA突變位點設計包含Class?IIS限制性內切酶識別位點和切割位點的引物，經分段PCR擴增、酶切、連接反應得到連接產物，并以該連接產物直接進行PCR擴增，實現DNA多位點突變。

2.如權利要求1所述的DNA多位點定向突變方法，其特征在于，包括如下步驟：

a.構建引物：

所述引物包括外部引物和內部引物；

其中，所述外部引物包括5’端的正向外部引物和3’端反向外部引物；

其中，所述內部引物包含正向內部引物和反向內部引物；所述內部引物自5’端到3’端依次為：保護堿基、Class?IIS限制性內切酶識別位點、Class?IIS限制性內切酶切割位點、以及目標基因區域；

b.分段PCR擴增：

利用所述內部引物和所述外部引物，進行分段高保真PCR擴增反應，各擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，回收獲得各目的片段；

c.酶切、純化：

將回收的所述目的片段分別用Class?IIS限制性內切酶進行酶切，經純化，得到酶切純化片段；

d.連接反應：

用T4DNA連接酶將步驟c中獲得的所述酶切純化片段連接，得到連接產物；

e.PCR擴增全長反應：

利用外部引物，以步驟d中的所述連接產物為模板，進行高保真PCR擴增全長。

3.如權利要求1所述的DNA多位點定向突變方法，其特征在于，所述突變是可同時在多位點的缺失突變、插入突變、置換突變。

4.如權利要求1所述的DNA多位點定向突變的方法，其特征在于，所述Class?IIS限制性內切酶包括Eco31I、BbvI、BsaI、Esp3I、SapI。

5.如權利要求1所述的DNA多位點定向突變的方法，其特征在于，所述高保真PCR反應是使用高保真DNA聚合酶進行PCR反應。

6.如權利要求1所述的DNA多位點定向突變的方法，其特征在于，所述PCR反應的反應體系包括：10μl?5×Buffer(Mg²⁺plus)，4μl?dNTP?mixture(各2.5mM)，1μl正向引物(10μM)，1μl反向引物(10μM)，0.1～100ng模板，0.5μl?DNA聚合酶(2.5U/μl)，加滅菌雙蒸水至總體積50μl。

7.如權利要求1所述的DNA多位點定向突變的方法，其特征在于，所述步驟b、d中PCR反應條件包括：94～98℃下變性10秒～5分鐘；94～98℃下變性10～30秒，45～65℃下退火0～30秒，68～72℃下延伸0.5～5分鐘，并進行28～32個循環；72℃延伸2～10分鐘。

8.如權利要求1所述的DNA多位點定向突變的方法，其特征在于，所述步驟c中酶切的反應體系包括：5μl10×Buffer，20～30μl所述回收目的片段，4μl?Class?IIS限制性內切酶，加滅菌雙蒸水至總體積50μl；所述步驟c中酶切的反應條件包括：先在37～65℃條件下反應5～30分鐘，再在65～80℃下反應5～30分鐘。

9.如權利要求1所述的DNA多位點定向突變的方法，其特征在于，所述步驟d中連接反應體系為：5μl10×Buffer，酶切純化產物片段，1～5U?T4DNA連接酶，加入滅菌雙蒸水至總體積為50μl。

10.如權利要求1所述的DNA多位點定向突變的方法，其特征在于，所述步驟d中連接反應的條件為4℃過夜，或16℃或室溫15分鐘～3小時。