[發(fā)明專利]葡萄球菌腸毒素小分子抗體及制備方法及用途

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310016121.0
• 申請(qǐng)日: 2013-01-16
• 公開（公告）號(hào): CN103224561A
• 公開（公告）日: 2013-07-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃金海;劉鵬翀;孫盈
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K16/12
• 分類號(hào): C07K16/12;C12N15/11;C12N15/85;G01N33/569
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

1.一種葡萄球菌腸毒素小分子抗體，是序列表中SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列。

2.一種葡萄球菌腸毒素小分子抗體的制備方法，包括如下步驟：

（1）制備葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞5C12；

（2）采用Trizol法提取葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞5C12總mRNA，以oligo(dT)₁₈為引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；

（3）在相對(duì)保守的FR1區(qū)和FR4區(qū)，設(shè)計(jì)由所述葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞5C12表達(dá)的單抗的輕鏈可變區(qū)基因的上、下游簡并引物，分別為SEQ?ID?No.8和SEQ?ID?No.9所示，以及由所述葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞5C12表達(dá)的單抗的重鏈可變區(qū)基因的上、下游簡并引物，分別為SEQ?ID?No.10和SEQ?ID?No.11所示；以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因，分別克隆至pUC-T?simple載體，經(jīng)測(cè)序及IMGT/V-QUEST、BLAST分析，確認(rèn)所獲序列符合鼠源抗體可變區(qū)經(jīng)典結(jié)構(gòu)，均為功能性V（D）J重排模式，其中，輕鏈可變區(qū)基因?yàn)镾EQ?ID?No.2所示，其編碼的多肽為SEQ?ID?No.3所示；重鏈可變區(qū)基因?yàn)镾EQ?ID?No.4所示，其編碼的多肽為SEQ?ID?No.5所示；

（4）設(shè)計(jì)輕鏈可變區(qū)基因的上、下游表達(dá)引物，分別用SEQ?ID?No.12和SEQ?ID?No.13所示，以SEQ?ID?No.2所示序列為模板，通過PCR擴(kuò)增，使輕鏈可變區(qū)基因序列C端修飾半胱氨酸及Sma?I和Xba?I酶切位點(diǎn)；設(shè)計(jì)重鏈可變區(qū)基因的上、下游表達(dá)引物，分別用SEQ?IDNo.14和SEQ?ID?No.15所示，以SEQ?ID?No.4所示序列為模板，通過PCR擴(kuò)增，使重鏈可變區(qū)基因序列C端修飾半胱氨酸及Nhe?I和HindIII酶切位點(diǎn)，同時(shí)在輕鏈可變區(qū)基因序列和重鏈可變區(qū)基因序列的N端引入Kozak序列；

（5）經(jīng)酶切、連接，將步驟（4）獲得的修飾的重鏈可變區(qū)基因序列插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，獲得pcDNA3.1-V_H過渡載體；

另以pIRESneo質(zhì)粒為模板，以SEQ?ID?No.16和SEQ?ID?No.17所示核苷酸為上、下游引物，通過PCR擴(kuò)增獲得ivs-IRES序列；同時(shí)以步驟（4）獲得的修飾的輕鏈可變區(qū)基因序列和ivs-IRES序列為模板，以SEQ?ID?No.12所示核苷酸為上游引物，以SEQ?ID?No.17所示核苷酸為下游引物，采用兩步法重疊PCR方法，擴(kuò)增獲得帶有后續(xù)重組操作BamHI和Xba?I酶切位點(diǎn)的ivs-IRES-V_L融合基因片斷，插入所述pcDNA3.1-V_H過渡載體，構(gòu)建真核單啟動(dòng)子共表達(dá)重組載體p5C12HILO，其中，5`-V<sub>H</sub>-ivs-IRES-V<sub>L</sub>-3`融合序列為SEQ?ID?No.6所示，p5C12HILO質(zhì)粒序列為SEQ?ID?No.7所示；

（6）通過Lipo2000脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞BHK-21細(xì)胞系，經(jīng)PCR鑒定和G418抗性篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)分泌細(xì)胞系。

3.權(quán)利要求1的抗體在葡萄球菌腸毒素檢測(cè)中的應(yīng)用。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是所述檢測(cè)為細(xì)胞間接免疫熒光檢測(cè)法。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是所述檢測(cè)為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法。