[發明專利]非洲爪蛙增殖誘導配體TNFSF13基因和蛋白質制備及應用

無效

• 申請號: 201310014635.2
• 申請日: 2013-01-15
• 公開（公告）號: CN103014016A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 張雙全;劉霞
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12N15/28
• 分類號: C12N15/28;C12N15/10;C12N15/70;C12N15/66;C12P21/02
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

1.非洲爪蟾增值誘導配體cDNA，其特征在于其序列如SEQID?NO.1所示。

2.一種權利要求1所述的洲爪蟾增值誘導配體cDNA的克隆方法，其步驟如下：

（1）提取非洲爪蟾脾臟總RNA，逆轉錄為cDNA第一鏈；

（2）設計引物擴增該基因的中間片段：

正義寡核苷酸引物：Xl-F：5’-?CTCTGGGGGGGTACAGGA?-3’

反義寡核苷酸引物：Xl-R：5’-?TTAAAGCCTGACAAGACCAAG-3’

（3）根據所得到的中間片段，設計引物擴增該基因的3’末端序列：

3’端正義寡核苷酸外引物：GSP-3F1’：?5’-TTCACGATGGGACACTTGATAACACGT?-3’?

3’端正義寡核苷酸內引物：GSP-3F2’：?5’-AGAGCWTGGCGTATAACACCTGTTACA?-3’?

3’端反義寡核苷酸外引物：

UPM?：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’

3’端反義寡核苷酸內引物：

NUP：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’

（4）根據所得到的中間片段，設計引物擴增該基因的5’末端序列：

5’端正義寡核苷酸外引物：UPM?5’-CTAATACGACTCACTATAGGG?CAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’

5’端正義寡核苷酸內引物：NUP：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’

5’端反義寡核苷酸外引物：GSP-5R1’：?5’-?GATCAGGCACCAGGTGAACATA-3’

5’端反義寡核苷酸內引物：GSP-5R2’:?5’-?AGGTTGCCAATGTGGATTGACTGGCACAT-3’?

(5)?將上述引物的PCR擴增產物，克隆入PMD19-T載體，并進行測序堿基序列測定，經軟件拼接得到了非洲爪蟾增值誘導配體基因的全長cDNA序列。

3.一種重組表達載體sumo-XsAPRIL的構建方法，其特征在于是根據權利要求1所述非洲爪蟾增值誘導配體cDNA序列設計帶有酶切位點的引物Xs-F和Xs-R，進行PCR擴增，得到如SEQ?ID?NO.4所示的非洲爪蟾APRIL基因胞外可溶區，將PCR產物割膠回收，回收產物用XhoI酶切,?SUMO?載體用StuI和XhoI?雙酶切；T4?DNA?Ligase連接酶切后的載體和PCR產物，得到sumo-XsAPRIL重組表達質粒；所述引物Xs-F和Xs-R序列分別如SEQ?ID?NO.18?和SEQ?ID?NO.19所示。

4.一種權利要求1所述的非洲爪蟾增值誘導配體cDNA的重組應用，是通過現有基因工程方法，生產重組非洲爪蟾增值誘導配體蛋白，作為免疫增強劑。