[發明專利]一種新型免疫性肝炎模型的建立方法及應用

在審

• 申請號: 201310014429.1
• 申請日: 2013-01-10
• 公開（公告）號: CN103920165A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 伍義行;沈鈺明;賈袁媛;張虹莉;戴靈豪
• 申請（專利權）人: 中國計量學院
• 主分類號: A61K49/00
• 分類號: A61K49/00;A01K67/027
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種動物疾病模型的制備方法，特別是一種簡單的免疫誘導劑及簡單的操作程序，產生與人類疾病更具有相似性的免疫性肝炎疾病模型及其在肝炎發病機制研究和抗肝炎藥物評價中的應用。

背景技術

免疫性肝炎是一組由異常免疫介導的、具有相似臨床表現的慢性免疫性肝病，是導致肝功能衰竭和肝硬化的重要病因。近年來，免疫性肝炎檢出率逐漸上升，在世界范圍內占慢性肝炎的10％～20％。涉及免疫性肝炎的誘因很多，發病機制非常復雜。免疫學細胞障害機制是肝損傷的重要機制之一，“免疫損傷”目前認為是乙肝病毒感染的主要致病機制，即乙肝病毒不直接殺傷肝細胞，感染后肝組織損傷是宿主一系列免疫反應造成的，包括以病毒抗原和肝細胞自身抗原為靶抗原進行免疫攻擊造成的損傷。雖然免疫性肝炎的自身抗體已經明確，但其病因和引起肝細胞損傷的機制卻仍未完全闡明，主要原因之一是缺乏理想的能夠模擬慢性進展性免疫損傷過程的動物模型。而現有的免疫性肝炎動物模型還不能涵蓋相應疾病的生理病理特點，僅僅是某些臨床癥狀類似，或者某些病理改變類似，尚無標準的免疫性肝炎動物模型可用。因此，建立與人類疾病在發病機制、病程特點等方面具有相似性的免疫性肝炎模型具有重要意義。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種新型的免疫性肝炎動物模型，該模型適用于常規實驗動物，實驗周期短，成模率高，簡單易行，而且耗費人力財力少，為肝炎發病機制的研究和新型抗肝炎藥物的開發提供一種與人類疾病更具相似性的、穩定可靠的疾病模型。為此，本發明采取以下技術方案：

現有的免疫性肝炎動物模型還不能涵蓋相應疾病的生理病理特點，僅僅是某些臨床癥狀類似，或者某些病理改變類似，尚無標準的免疫性肝炎動物模型可用。而用本發明采用乙肝病毒全基因組轉染小鼠肝細胞誘導建立的免疫性肝炎小鼠模型，由于乙肝病毒轉基因小鼠肝細胞既含有肝自身抗原，又含有乙肝病毒抗原，能更好地模擬人類免疫性肝炎尤其是病毒感染誘導的免疫性肝炎。

一種用乙肝病毒全基因組轉染小鼠肝細胞誘導，無需特殊裝置，簡單易行，實驗周期短的免疫性肝炎動物模型的建立方法。具體制備方法如下：

取6周齡的ICR小鼠或C57BL/6小鼠，通過腹腔注射乙肝病毒轉基因小鼠肝細胞乳劑，每只0.2毫升，共2-3次，即可誘發產生免疫性肝炎。

本發明與現有技術相比具有如下優點：(1)采用乙肝病毒轉基因小鼠肝細胞作為免疫誘導劑，由于乙肝病毒轉基因小鼠肝細胞既含有肝自身抗原，又含有乙肝病毒抗原，能更好地模擬免疫性肝炎；(2)無需特殊裝置，簡單易行，實驗周期短，成模率高；(3)與人類免疫性肝炎尤其是病毒感染誘導的免疫性肝炎具有良好的相關性；(4)適于肝炎發病機制研究和抗肝炎藥物評價。

具體實施方式

實施例1：免疫性肝炎模型的制備及評價

1準備以下材料：

1.1實驗動物：ICR小鼠和C57BL/6小鼠由浙江省實驗動物中心提供。

1.2乙肝病毒全基因組轉染小鼠：上海南方模式動物中心提供。

1.3脂多糖：美國SIGMA公司產品。

2制備方法按如下步驟：

2.1采用灌流的方法分離純化乙肝病毒全基因組轉染小鼠肝細胞。

2.2分離的肝細胞用磷酸鹽緩沖液懸浮，經超聲破碎后，與Freund’s完全佐劑按1∶1比例充分混勻，呈白色乳劑，即免疫誘導劑。

2.3清潔級ICR小鼠或C57BL/6小鼠，雌雄各半，常規飼養。

2.4取6周齡小鼠，腹腔注射免疫誘導劑1次/周、0.2毫升/只，共2-3次。

2.5誘導劑免疫注射2-3次后，即可形成典型的免疫性肝炎模型。

3評價方法按如下步驟：

3.1建模后檢測小鼠血清白蛋白/球蛋白(A/G)、谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)、IgG和IgM水平。

3.2建模后采用間接免疫熒光法等檢測標志性自身抗體，包括抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗體(SLA/LP)和抗肝腎微粒體I型抗體(LKM-1)、抗肝細胞質1型抗體(LC-1抗體)和抗肝細胞膜特異性脂蛋白抗體(ALSP)水平。

3.3實驗結束后，處死小鼠，取肝臟組織作病理學檢查，觀察模型小鼠出現的免疫性肝炎特征性病變——界面性肝炎(位于肝小葉實質區與間質區交界處出現碎屑樣壞死伴有炎癥細胞浸潤)。