[發明專利]利用高通量組織芯片檢測BSP在腦膠質瘤中的表達的方法

無效

• 申請號: 201310012888.6
• 申請日: 2013-01-14
• 公開（公告）號: CN103088130A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 陳菊祥;徐濤;秦榮;盧亦成;嚴勇;周勁旭;王洪祥
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N33/68
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達

技術領域

本發明屬于檢測BSP在腦膠質瘤中的表達領域，特別涉及一種利用高通量組織芯片檢測BSP在腦膠質瘤中的表達的方法。

背景技術

膠質瘤是中樞神經系統（CNS）中最多見的腫瘤，其中70%是惡性膠質瘤，是CNS起源的腫瘤中最常見和最致命的腫瘤，具有高復發率和死亡率。膠質瘤中最有生物學侵襲性的亞型是多形性膠質母細胞瘤（GBM，WHO?IV級的星形膠質細胞瘤），其預后令人沮喪。目前的標準治療方案包括最大程度的切除腫瘤以及隨后使用DNA烷化劑、替莫唑胺進行化療和放療。但盡管經過上述的有效治療，GBM和間變型星形細胞瘤（WHO?III級）的預后生存期仍很短，中位生存期分別只有約14-16個月和2-5年。

目前已做了大量的努力來鑒定GBM中的基因學變化或其分子靶標，這些基因變化或分子靶標有助于區分GBM患者的不同亞組，每個亞組有不同的預后和對特異性治療不同的臨床反應。替莫唑胺臨床反應最主要的決定因素之一是MGMT的甲基化水平。MGMT啟動子甲基化可見于40%-60%的病人，并與對替莫唑胺治療的良好反應相關。最近，在多達75%的2級和3級彌漫性星形細胞瘤中發現了基因編碼的異檸檬酸脫氫酶（IDH1）的突變，目前已發現IDH1的突變是2-4級膠質瘤總體生存期和無進展生存期的一個主要的預后指標。

腫瘤的侵襲能力通常可通過癌細胞的高運動性和用于降低胞外基質的蛋白酶的表達量增加來預測。骨唾液蛋白（BSP）作為基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）的一個特異性的調控者，由IBSP基因編碼，屬于小型N端連接整合糖蛋白（SIBLING）基因家族一員。BSP在諸如前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等多種癌癥中都是高表達的，并可能有助于這些癌的侵襲潛能。一項早期的研究表明BSP對于臨床局限的前列腺惡性腺癌在統計學上有顯著的預后價值。類似的結果在非小細胞肺癌、乳腺癌、人類上皮癌、胰腺癌和骨肉瘤中都有發現。但在膠質瘤組織中尚未有BSP的表達及其預后價值的研究。

組織芯片(TMA)技術的發展，得益于生物芯片技術等的延伸。TMA具有高通量、快速、低誤差、用途廣泛等特點，目前主要應用在腫瘤病理學、實驗室檢測、藥物研究等。利用組織芯片技術可以在細胞水平定位和蛋白水平檢測相應靶標，從而實現基因及其表達產物與組織形態學研究以及臨床數據相結合，同時還可以與原位雜交技術等相結合，因此TMA被廣泛應用在腫瘤病理研究中,例如EMSY通路在乳癌及卵巢癌中的關系，AlphaB-Crystallin與乳癌的關系，TMPRSS2和ETS轉移因子在前列腺癌的重要作用等。

TMA常見類型有演化TMA、預后TMA等。演化TMA指將某一腫瘤疾病發展的各個階段的標本（諸如原發間變和繼發膠母、原發膠母和復發膠母等）集中在一塊TMA中，能在一張切片上同時看到腫瘤組織在原位、轉移、復發等不同進展階段的變化情況，可用以檢測特定腫瘤在不同發展階段的分子病理改變，有助于對腫瘤發生、發展及浸潤轉移等過程的研究。預后TMA是將帶有可利用的臨床隨訪數據的腫瘤標本集中在一張TMA中。使用預后TMA可以研究已知的分子靶標的改變或信號傳導通路的變化對腫瘤患者預后的影響^[2]。TMA陣列中每個組織片段都對應于相應患者，因此利用TMA，結合臨床數據和隨訪資料，可以對腫瘤患者進行大規模的回顧性數據分析，為疾病的早期診斷、早期治療等提供指導。文獻報道利用預后TMA發現Cyclooxygenase-2對鼻咽癌患者放療預后有預測價值。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種利用高通量組織芯片檢測BSP在腦膠質瘤中的表達的方法，該方法使得檢測BSP的表達的靈敏性大大提高，能保證在極少的標本中獲得足夠的信息。

本發明的一種利用高通量組織芯片檢測BSP在腦膠質瘤中的表達的方法，包括：

（1）使用Trizol試劑將腦組織進行總RNA的分離；

（2）對步驟（1）得到的總RNA進行反轉錄，得到cDNA；

（3）將上述cDNA與SYBR熒光染料混合并進行擴增；

（4）IBSP的表達通過抗GAPDH進行標準化，使用以下方程進行比較閾值循環法：表達折疊差異=2^{-(Δ目標基因的ct值-Δ參照ct值)}；

（5）構建組織芯片，然后進行免疫組化染色，對免疫組化結果進行統計分析，檢測BSP在腦膠質瘤中的表達。

步驟（1）中所述的腦組織為膠質瘤或正常腦組織。

步驟（2）中所述的總RNA的質量為2ug，得到cDNA的質量為20ng。