[發明專利]新風膠囊水溶性蛋白分子量檢測方法

有效

• 申請號: 201310011369.8
• 申請日: 2013-01-11
• 公開（公告）號: CN103149262A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 劉健;孟楣;高家榮;王曉玉;姜輝
• 申請（專利權）人: 安徽中醫學院第一附屬醫院
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447;G01N1/28;G01N1/30;G01N1/38
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技術領域

本發明涉及中藥類水溶性蛋白分子量的檢測領域，具體是涉及一種新風膠囊水溶性蛋白分子量檢測方法。

背景技術

新風膠囊系安徽中醫學院第一附屬醫院的醫院制劑(皖藥制Z20050062)，該藥由黃芪、薏苡仁、雷公藤和蜈蚣4味中藥組成，具有益氣健脾，化濕通絡之功效，具有廣闊的開發前景。

隨著分子生物學的快速發展及應用，為中藥的質量控制提供了新的思路。由于中藥主要來源于動植物等生物體，其細胞內都含有受遺傳基因調控、代表其品種特征性的蛋白質分子，不同蛋白質的分子大小、空間結構和電荷數目上的差異，可以通過電泳得到分離。因此，應用現代分子生物學的原理和方法，將中藥制劑質量評價技術從形態、組織、細胞推進到分子水平，對中藥制劑中蛋白質成分分析，可以解決目前中藥制劑鑒定以及內在質量評價的難題。

發明內容

針對現有技術中存在的技術問題，本發明提供了一種新風膠囊水溶性蛋白分子量檢測方法，將SDS-PAGE電泳方法應用于新風膠囊中水溶性蛋白成分測定，為建立該制劑電泳特征圖譜提供依據。

為了實現上述目的，采用的技術方案如下：

新風膠囊水溶性蛋白分子量檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

①、試劑的配制

電極緩沖液，稱取甘氨酸5.0g、三羥甲基氨基甲烷3.0g，十二烷基磺酸鈉1.0g，加適量雙蒸水溶解后，用1mol/l鹽酸調pH至8.3，然后加雙蒸水至1000ml，置于4℃保存；

固定液，稱取三氯醋酸5.0g，加雙蒸水200ml溶解后，加甲醇200ml，再加雙蒸水至500ml；

考馬斯亮藍脫色液，量取乙醇400ml、冰醋酸100ml與雙蒸水500ml，混勻；

1％瓊脂糖溶液，稱取瓊脂糖0.2g，加電極緩沖液20ml，加熱溶解成澄清溶液；

10％過硫酸銨溶液，稱取過硫酸銨0.1g，加1ml雙蒸水溶解至澄清；

②、供試品溶液的制備

取新風膠囊內容物5.0g，于研缽中研成細粉，加6ml?1M?Tris-HCl緩沖液溶解，研勻，靜置5min，4000r/min離心20min，吸取上清液900μl，加300μl?4×蛋白質上樣緩沖液混合，沸水浴5min，以12000r/min離心20min，冷卻后吸取上清液分裝，每管分裝20μl，-20℃貯存；

③、電泳槽的安裝

電泳槽的各部件在組裝前均需清洗干凈，選擇水平操作臺面，首先將白色內芯放入黑色內槽中，然后將電泳玻璃采取凹形玻璃板在白色內芯內側、矩形玻璃板在白色內芯外側的方向，順著白色內芯一側的膠條小心放入內芯；

當兩側的玻璃全部放入到白色內芯后，確認凹、平板的底部邊緣均與黑色內槽密封槽平齊，旋緊緊固旋鈕；

用移液槍吸取1％瓊脂糖溶液，沿密封槽一端灌入封閉玻璃板，為防止留存氣泡，稍抬起一端趕去氣泡，瓊脂糖溶液需進入膠室0.9～1.1cm，凝固5～7min后進行灌膠操作；

④、凝膠的制備

按4ml?1.5M?Tris-HCl緩沖液、6.7ml?30％丙烯酰胺、1.6ml?1％十二烷基磺酸鈉、0.1ml?10％四甲基乙二胺、0.1ml?10％過硫酸銨和3.3ml雙蒸水配制12.5％分離膠溶液，然后開始灌膠，并防止氣泡產生，水封室溫下聚合；

待分離膠溶液聚合后，用濾紙吸取上面的水層，再灌入4.5％濃縮膠溶液，并插上樣品梳，4.5％濃縮膠溶液按1.35ml?30％丙烯酰胺、0.9ml?1％十二烷基磺酸鈉、0.07ml?10％四甲基乙二胺、0.07ml?10％過硫酸銨、2.25ml?1M?Tris-HCl緩沖液和4.33ml雙蒸水配制；

⑤、上樣與電泳

待濃縮膠溶液聚合后，雙手輕取出梳子，提住白色把手將黑色內槽放入外槽中，用微量注射器吸取樣品提取液5μl，緩緩注入加樣孔中，動作要輕，不能破壞膠面；

在黑色內槽內部和外部分別加注電極緩沖液，內部液面高度要高過凹板下沿10mm，外部液面高度為外槽的1/3；

蓋上安全蓋，接通電泳儀，80v電壓1小時后，待溴酚藍示蹤指示劑前沿到達分離膠上沿時，把電壓調至100v，待示蹤指示劑行至距瓊脂層0.9～1.1cm時，關閉電源，停止電泳，整個電泳過程需要3～4個小時；

⑥、染色與脫色

電泳結束后，打開電泳槽，取出凝膠，切去濃縮膠，保留分離膠并標記溴酚藍前沿，置固定液中固定半小時后，取凝膠放入適量考馬斯亮藍染色液中，確保染色液可以充分覆蓋凝膠，置于水平搖床上緩慢搖動，室溫染色1.5～2.5小時；