[發明專利]非放射性判別膜蛋白質轉運功能的方法

無效

• 申請號: 201310011115.6
• 申請日: 2013-01-11
• 公開（公告）號: CN103076412A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 李冬海;張文;江雪源;張辰宇
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 唐循文

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技術領域

本發明涉及膜蛋白質功能判別技術領域，尤其涉及一類非放射性判別膜蛋白質轉運功能的方法。

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背景技術

膜蛋白結構與功能的研究作為研究藥物靶向性的基礎對治療疾病的發展是必不可少的。目前研究膜蛋白功能的普遍方法主要是以結構為基礎的功能性研究，并且生物信息學技術作為核心方法被廣泛的應用到對蛋白的結構以及功能方面進行預測。首先，通過在數據庫中搜索目標蛋白的序列信息并且進行比對，包括同源序列，拓撲結構，功能團，進化，具體功能相關序列分析等。在預測結構的基礎上，膜蛋白的功能研究還主要依賴各種現代生物物理儀器，包括質譜儀，核磁共振儀，X射線儀，紅外/紫外/光散射光譜儀等。但是，由于膜蛋白不易于過表達，純化甚至是結晶，再加上無法確保膜蛋白的天然構象，因此在其轉運功能方面的研究還是面臨很大的困難的。

目前已經有很多文獻通過應用放射性元素示蹤的方法報道和研究了相關膜蛋白的轉運功能，主要的研究方法是利用脂質體結構的特性模擬細胞膜結構，將目的蛋白插入到脂質體結構的表面。首先用做好的帶有轉運蛋白的膜結構包裹放射性元素標記的底物。在該混合物的基礎上添加放射性元素標記的底物交換物。允許轉運反應發生一段時間后應用蛋白抑制劑停止膜蛋白上的轉運活動。最后，通過比較同位素標記的底物以及被交換物與各自標準含量的差別從而判斷蛋白轉運的情況。

同位素示蹤法是利用放射性核素作為示蹤劑對研究對象進行標記的微量分析方法，其主要原理是利用核探測器隨時追蹤放射性同位素不斷地放出的特征射線，從而示蹤同位素在體內或體外的位置、數量及其轉變等。目前應用比較廣泛的是放射性同位素法。該方法的優點在于其靈敏度高，測量方法簡便易行，能準確地定量，準確地定位及符合所研究對象的生理條件等特點。穩定同位素因作為一種不釋放射線的示蹤劑，其靈敏度較低，可獲得的種類少，而且價格較昂貴導致它的應用范圍受到限制。就該方法的優點而言，膜蛋白上的轉運活動的確能夠準確的定位以及定量，但是，即便采取放射防護措施，放射性元素的對機體的損害也是難以避免的。操作者的損害程度與放射照射量，放射照射時間，以及放射射線種類都有直接關系。放射可以導致機體組織器官發生病變直至誘發癌變，并且會引發遺傳缺陷。更重要的是放射性污物會污染環境進而影響他人的身體健康。除了健康隱患外，該方法不僅價格昂貴，操作需要的用量以及操作形式都需要謹慎。更重要的是該方法對實驗環境的要求很高，需要在對周圍環境沒有污染的，嚴格密閉的條件下進行操作，并切配備先進的生物物理儀器。同位素失蹤法已經為研究膜蛋白轉運功能方面提供了不可小視的貢獻，但是就該方法的推廣性以及安全性而言，該方法也有它不可避免的弊端。

除了同位素示蹤法，另外一種被廣泛應用研究膜蛋白轉運功能的方法是通過檢測在線粒體上轉運后的物質與其他胞內物質反應后的生成物從而判斷是否轉運的方法。例如研究腺甘酸轉運體（ANT4）轉運ATP/ADP的功能，通過添加不同濃度的ADP，并且在不同濃度條件下檢測NADPH的生成而判斷ATP的生成。該方法雖然在體外水平能夠保持天然膜蛋白的功能，但是實驗準備條件苛刻，耗時長，需要大量培養細菌并且以及提取新鮮的線粒體。