[發明專利]基于轉座子的分子引物對家蠶微孢子蟲的分型檢測方法

無效

• 申請號: 201310010934.9
• 申請日: 2013-01-11
• 公開（公告）號: CN103088129A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 許金山;周澤揚;潘國慶;王林玲;李治;黨曉群
• 申請（專利權）人: 重慶師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所 50211
• 代理人: 郭云

1.一種基于轉座子的分子引物對家蠶微孢子蟲的分型檢測方法，其特征在于，按照如下步驟完成：

（1）、用CTAB方法提取家蠶樣本微孢子蟲的基因組DNA；

（2）、用MseI酶完全消化步驟（1）所得的家蠶樣本微孢子蟲的基因組DNA，并與接頭引物混合連接，形成連接混液，具體反應為0.5ml離心管中加入下列反應物并且混合均勻：

接頭引物：5′-CAGGGTGGGCAAA-3′??????????????SEQ?NO?1；

（3）、將步驟（2）所得的連接混液取1μl，在以下25μl反應體系中進行預擴增：

A.在0.5ml離心管中加入以下反應物并且混合均勻：

PCR反應擴增的引物：

NbME5特異引物：5′-AAAGTTTGCCCACCCCTG-3′??????????SEQ?NO?2

NbME1特異性引物：5′-CCCTTGGGAAACACTG-3′??????????SEQ?NO?3

B.將步驟A所得的溶液通過離心后，按以下參數進行PCR擴增：

（4）將步驟（3）所得的預擴增產物稀釋20倍后，再進行第二輪PCR擴增的DNA模板，對稀釋后的產物加入錨定引物和NbME特異性引物后，在20μL體系下進行擴增。反應體系如下：

A.在0.5ml離心管仲加入下列反應物并且混合均勻

NbME5特異引物：5′-AAAGTTTGCCCACCCCTG-3′??????????SEQ?NO?2

NbME1特異性引物：5′-CCCTTGGGAAACACTG-3′??????????SEQ?NO?3

錨定引物1：5′-CAGGGTGGGCAAACT-3′?????????????????SEQ?NO?4

錨定引物2:5′-CAGGGTGGGCAAACA-3′??????????????????SEQ?NO?5

B.將步驟A所得的溶液通過轉速離心后,按下列參數進行梯度PCR擴增：

1）、第一輪擴增參數：

2)、循環步驟1)中的步驟b至步驟d，每輪循環退火溫度遞減0.7℃，擴增12輪；

3）、繼續按以下參數擴增23輪：

（5）凝膠分析

A.制備1%的瓊脂糖凝膠；

B.梯度PCR擴增產物與6×Loading?buffer以8：2混合；

C.上樣10μL；

D.220V電泳，溴酚蘭至膠2/3處停止電泳；

E.EB染色15-20min，觀察結果。

2.根據權利要求1所述的基于轉座子的分子引物對家蠶微孢子蟲的分型檢測方法，其特征在于：所述微孢子蟲特異性MITE分型法檢測引物核苷酸序列：

NbME5特異引物：5′-AAAGTTTGCCCACCCCTG-3′??????????SEQ?NO2；

NbME1特異性引物：5′-CCCTTGGGAAACACTG-3′??????????SEQ?NO3；

接頭引物：5′-CAGGGTGGGCAAA-3′????????????????????SEQ?NO1；

錨定引物1：5′-CAGGGTGGGCAAACT-3′?????????????????SEQ?NO4；

錨定引物2:5′-CAGGGTGGGCAAACA-3′??????????????????SEQ?NO5；

是通過分析測序的家蠶微孢子蟲全基因組數據，經過生物信息學分析微孢子蟲的基因組而設計得到的該組微孢子蟲特異性MITE分型法檢測引物。

3.根據權利要求1所述的基于轉座子的分子引物對家蠶微孢子蟲的分型檢測方法，其特征在于：所述步驟（3）中的步驟B，離心的條件轉速為3000轉，離心時間為8～10s。

4.根據權利要求1所述的基于轉座子的分子引物對家蠶微孢子蟲的分型檢測方法，其特征在于：所述步驟（4）中的步驟B，離心的條件轉速為3000轉，離心時間為8～10s。

5.根據權利要求1所述的基于轉座子的分子引物對家蠶微孢子蟲的分型檢測方法，其特征在于：所述步驟（1）中，家蠶樣本微孢子蟲的基因組DNA可以為小量樣品。