[發明專利]一種采用豬脾臟高效生產精制豬白細胞干擾素的方法

無效

• 申請號: 201310008071.1
• 申請日: 2013-01-10
• 公開（公告）號: CN103923960A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 李廣善;傅李芳
• 申請（專利權）人: 北京紫辰醫藥生物技術研究所
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C07K1/20;C07K1/18
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種采用豬脾臟作原料高效生產精制豬白細胞干擾素的方法，屬于采用細胞分離技術、組織培養技術、誘導發酵技術及制劑技術對豬脾臟進行深加工的生物制藥技術領域。

背景技術

豬白細胞干擾素是一種純天然的具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和增強機體免疫力功能的細胞因子，同時具有使用安全、治療效果好、生產成本低等特點，臨床用于豬病毒性高熱病、瘟病、藍耳病、腹瀉等多種傳染性疾病的防治，收到了滿意效果。

目前市場銷售和使用的豬白細胞干擾素多采用豬血白細胞作原料生產制備的粗制品。由于豬血收集困難，不易大量儲存，且產品未經任何純化提取，含有大量細胞組織、培養基及其它未知病原微生物等有害成分，導致其生物活性低(每ml僅含干擾素1-2萬活性單位)，臨床治療效果差。因此有必要在擴大豬白細胞來源的同時，進一步將粗制豬白細胞干擾素提取純化，以改進產品質量，提高治療效果，滿足日趨嚴重的家畜病毒性傳染病防治的需要。

發明內容

本發明目的在于采用豬脾臟代替豬血作原料分離白細胞，經誘導發酵、層析分離純化，高效生產精制豬白細胞干擾素，從而拓寬了豬白細胞干擾素生產原料的來源。該方法生產的精制豬白細胞干擾素生物活性高(每ml可含干擾素數百萬活性單位)，副作用小、治療效果好，且生產原料來源廣、取材方便、易于儲存、工藝簡捷、回收率高、成本低，便于規?；藴驶凸I化生產。

上述目的是這樣實現的：采集健康豬新鮮脾臟，-10℃以下冰凍保存；使用時室溫無菌水浴融化，剝離脾臟表面的脂肪和結締組織；粉碎后加入含卡那霉素和慶大霉素的磷酸鹽緩沖液洗滌，4℃2000rpm離心15分鐘離心；加入0.25％胰蛋白酶，37℃保溫消化30分鐘；用不含抗生素的緩沖液洗滌2次，不銹鋼濾網過濾，4℃2000rpm離心15分鐘，收集白細胞沉淀物；用MEM培養液稀釋細胞沉淀物，制備成10⁷/ml濃度的白細胞懸液，注入到發酵罐中，同時加入新城雞瘟病毒(NDV)誘導劑，濃度為100血凝單位/ml；37℃，pH6.0-7.0，300rpm，通氣量3-5L/分，容氧度40-50％，誘導培養發酵18-20小時；4℃，4000rpm離心30分鐘收集上清；用鹽酸調pH至2.0，4.0℃放置3天，滅活病毒，再用氫氧化鈉調pH至6.8，4℃，4000rpm離心30分鐘收集上清，即粗制豬白細胞干擾素原液；先經陰離子層析，再經高壓反向層析純化，收集洗脫鋒即精制豬白細胞干擾素原液；0.22μm微孔濾膜過濾除菌制劑，無菌分裝真空冷凍干燥即制備成精制豬白細胞干擾素粉針。

附圖說明

采用豬脾臟高效生產精制豬白細胞干擾素的方法步驟如附圖所示。

具體實施方式

采用豬脾臟高效生產精制豬白細胞干擾素具體實施方式如下：

1、從豬脾臟分離白細胞

(1)無菌采集健康豬新鮮脾臟，-10℃以下冰凍保存備用；

(2)使用時室溫無菌水浴融化，剝離脾臟表面的脂肪和結締組織，用組織粉碎機粉碎成1-2mm³碎塊；

(3)加入含慶大霉素40單位/ml、卡那霉素150μg/ml的pH6.8的磷酸鹽緩沖液洗滌，4℃2000rpm離心15分鐘，收集細胞組織沉淀物；

(4)加入0.25％胰蛋白酶，37℃保溫消化30分鐘；

(5)用不含抗生素的磷酸鹽緩沖液洗滌2次，不銹鋼濾網過濾，4℃2000rpm離心15分鐘，收集白細胞沉淀物。

2、誘導發酵制備粗制豬白細胞干擾素原液

(1)用MEM培養液稀釋白細胞沉淀物，制備成白細胞懸液，注入到發酵罐中，同時加入新城雞瘟病毒(NDV)誘導劑，濃度為100血凝單位/ml；

(2)啟動發酵罐，37℃，pH6.5-7.0，300rpm，通氣量3-5L/分，容氧度40-50％，誘導培養發酵18-20小時；

(3)4℃，4000rpm離心30分鐘，收集上清；

(4)加入鹽酸調pH至2.0，4.0℃放置72小時，滅活病毒；

(5)用氫氧化鈉調pH至6.8，4℃，4000rpm離心30分鐘，收集上清，即粗制豬白細胞干擾素原液。

3、層析純化制備精制豬白細胞干擾素原液

(1)將粗制豬白細胞干擾素原液上DEAE?Sepharose?FF柱，15-20ml/分，用Nacl緩沖液作0.1-0.6M/L線性梯度洗脫，流速10ml/分，收集洗脫峰；