[發明專利]一種利用哌啶水溶液檢測DNA中5-醛基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶的方法

無效

• 申請號: 201310007487.1
• 申請日: 2013-01-09
• 公開（公告）號: CN103060450A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 周翔;毛伍祥;郭楓晚
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

技術領域

????本發明涉及一種利用哌啶水溶液檢測DNA中5-醛基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶的方法，屬于DNA測序領域。

背景技術

表觀遺傳學作為遺傳學的一門重要分支學科，主要研究基于非基因序列改變所致基因表達水平變化,其主要內容包括DNA甲基化、基因組印記、RNA干擾和組織蛋白修飾等。近幾年來，越來越多的人開始關注DNA甲基化，相關的研究更是如火如荼的開展起來。DNA甲基化是最早發現的修飾途徑之一，其存在與基因的沉默與表達有著密切的聯系。通常在甲基化轉移酶的作用下甲基化發生在胞嘧啶的C5位，形成5-甲基胞嘧啶（5mC），接著TET家族酶處理后，5mC轉化成5-羥甲基胞嘧啶（5hmC），5hmC可以進一步氧化成5-醛基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），5caC被TDG酶切除，最后通過堿基缺失修復還原成胞嘧啶，這是一個完整的去甲基化過程。這些年來，5?mC得到廣泛的研究，作為一種穩定且重要的表遺傳修飾，參與基因表達調控、X-染色體失活、基因組印記、轉座子的長期沉默和癌癥的發生，被稱為基因組第五堿基；而5hmC的存在，近年來應用了高精確的質譜分析和高通量測序方法，發現5hmC的形成與惡性血液腫瘤相關;?最新報導5fC的存在與RNA的轉錄酶Ⅱ的轉錄速率和底物特異性有著十分重要的聯系。關于DNA甲基化檢測的文章已經報導了很多，而作為2011年剛被發現的5fC卻很少得到檢測。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供了一種快速、有效和靈敏的分別檢測5-醛基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶的方法。

本發明提供的技術方案是：一種DNA中5-醛基胞嘧啶的檢測方法，具體為：向帶熒光標記的DNA中加入哌啶的水溶液，哌啶的體積濃度為5%~20%，加熱后旋干溶劑，上樣至電泳槽記錄5-醛基胞嘧啶的位置和個數；

一種DNA中5-羥甲基胞嘧啶的檢測方法，具體步驟為：

1）向帶熒光標記的DNA中加入哌啶的水溶液，哌啶的體積濃度為5%~20%，加熱后旋干溶劑，上樣至電泳槽記錄5-醛基胞嘧啶的位置和個數；

2）將帶熒光標記的DNA加入到高釕酸鉀存在的氫氧化鈉的水溶液中反應，分離出帶熒光標記的DNA，然后加入哌啶的水溶液，加熱后旋干溶劑，上樣至電泳槽記錄5-醛基胞嘧啶位置和個數，與步驟1）中檢測到的5-醛基胞嘧啶的位置和個數進行比較得到DNA中5-羥甲基胞嘧啶的位置和個數。

哌啶特異性的與帶熒光標記DNA中的5-醛基胞嘧啶反應，而經高釕酸鉀氧化后的5-羥甲基胞嘧啶轉化為5-醛基胞嘧啶，也可以與哌啶反應。通過比較變性膠中兩個反應的DNA帶可以清楚的看到5-醛基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶的位置和個數。

本發明是通過哌啶與DNA中5-醛基胞嘧啶特異性的反應，經過哌啶的熱處理會使DNA中5-醛基胞嘧啶的位置特異性的斷裂，從而會在20%的DNA聚丙烯酰胺變性膠上看到特異性的DNA斷裂帶，從而確定DNA中5-醛基胞嘧啶在DNA序列中的位置。而對于含有5-羥甲基胞嘧啶的DNA，它會被高釕酸鉀（KRuO₄）氧化成5-醛基胞嘧啶的DNA，同樣經過哌啶處理后會在變性膠上顯示出5-醛基胞嘧啶的位置。通過比較兩條膠帶可以看出經氧化劑氧化后新生成的DNA斷裂帶就是5-羥甲基胞嘧啶的位置。

本方法可以實現快速、有效和靈敏的分別檢測5-醛基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶。

附圖說明

圖1為實施例1~4的變性膠圖結果比較，圖中的泳道1代表實施例4中的對照實驗的結果，2~5依次代表實施例1~4的結果。

圖2為實施例5中步驟1）和步驟2）的照膠結果，其中，“-”代表步驟1）沒有經過KRuO₄處理直接哌啶處理，“+”代表步驟2）經過KRuO₄處理后哌啶處理，圖中的1234分別代表不同的DNA序列，其中，1代表只含有一個羥甲基胞嘧啶的DNA序列，2代表只含有一個甲基胞嘧啶的DNA序列，3代表只含有一個醛基胞嘧啶的DNA序列，4代表同時含有這三種特殊胞嘧啶的DNA序列；XYZ分別表示序列中的不同的位置。

具體實施方式

以下以具體實例對本發明的技術方案做進一步的說明。

實施例1：5-醛基胞嘧啶DNA與5%?哌啶的反應

取5-醛基胞嘧啶DNA（10?μM）2?μL加入93?μL的水和5?μL的哌啶，?90℃熱處理0.5小時后，旋干溶劑，上樣至電泳槽，2?h后觀察照膠結果，有10%?的5-醛基胞嘧啶DNA發生斷裂。