[發明專利]一種microRNA的二次循環擴增檢測方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201310007183.5
• 申請日: 2013-01-09
• 公開（公告）號: CN103088128A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 夏帆;段瑞雪;陳志飛;左小磊
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 華中科技大學專利中心 42201
• 代理人: 夏惠忠

1.一種miRNAs的二次方循環擴增檢測方法，包括以下步驟：

步驟一：37℃條件下的標準曲線：取5-8個1.5ml的離心管，分別加入分子信標探針、8個堿基的引物、dNTPs、Bst聚合酶、Nb.BbvCI切刻內切酶、lambda核酸外切酶、BSA、RRI，另外設計5-8個濃度梯度(10fM-100nM)的miRNA樣品分別加入到以上離心管中37℃恒溫孵育2h；所述的分子信標探針的核苷酸序列為：

其5′端的兩個堿基有硫代標記，3′端標記有淬滅基團DABCYL，另外還含有Nb.BbvCI切刻酶的切刻位點GCTGAGG(下劃線)；靠近5′端第10個堿基處標記有熒光基團FAM；所述的8個堿基的引物的核苷酸序列為：其5′端的兩個堿基也是硫代標記。

步驟二：熒光儀上進行檢測，即可得到不同濃度的miRNA樣品對應的熒光強度，熒光儀的設置參數如下：激發和發射狹峰寬度均為5nm，電壓PMT?700v，激發波長為490nm，發射波長掃描范圍500～600nm，根據熒光強度和miRNA樣品濃度可得37℃條件下的檢測標準曲線；

步驟三：改變步驟一中的反應條件為4℃恒溫孵育50h，其它條件不變，可得4℃條件下的檢測標準曲線；

步驟四：對于乳腺癌細胞的檢測，首先利用mirVana^TM試劑盒提取出細胞中的miRNA，作為待檢測的樣品，利用步驟一中的條件可以得到乳腺癌細胞的檢測標準曲線；

步驟五：將分子信標探針、8個堿基的引物、dNTPs、Bst聚合酶、Nb.BbvCI切刻內切酶、lambda核酸外切酶、BSA、RRI、以及待測樣品加入到1.5ml的EP離心管中恒溫孵育2h，在熒光儀上進行檢測，熒光儀的參數設置與步驟二中熒光儀的參數設置相同，得到的熒光強度和檢測標準曲線相對應即可得到樣品中含有的miRNA的濃度。

2.根據權利要求1所描述的miRNAs的二次方循環擴增檢測方法，其特征在于，反應總體積為50μL，反應成份的濃度為：

分子信標探針：500nM；

引物：2μM；

dNTPs：400μM；

Bst聚合酶：16U；

Nb.BbvCI切刻內切酶：15U；

lambda核酸外切酶：12.5U。

3.根據權利要求1所描述的miRNAs的二次方循環擴增檢測方法，其特征在于，對于一個未知樣品可以先在37℃恒溫下反應2h，若得到的信號和本底相同，則可能有兩種情況，一是樣品中不含miRNA或者是其含量在10fM以下，這時可以改反應條件為4℃下反應50h；如果樣品的濃度是在10aM以上的可以被檢測出。

4.一種miRNA熒光檢測試劑盒，包括：

分子信標探針，8個堿基引物，Bst聚合酶，Nb.BbvCI切刻內切酶，Lambda核酸外切酶，NEB?buffer?3，dNTPs，DEPC水，BSA，RRI。

所述的分子信標探針的核苷酸序列為：

其5′端的兩個堿基有硫代標記，3′端標記有淬滅基團DABCYL，另外還含有Nb.BbvCI切刻酶的切刻位點GCTGAGG(下劃線)；靠近5′端第10個堿基處標記有熒光基團FAM；所述的8個堿基引物的核苷酸序列為：其5′端的兩個堿基也是硫代標記。

5.根據權利要求4所述的miRNA熒光檢測試劑盒，其特征在于，還包括使用說明書。