[發明專利]一種轉精氨酸酶基因玉米育種方法

有效

• 申請號: 201310004209.0
• 申請日: 2013-01-07
• 公開（公告）號: CN103045641A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 王振華;邸宏;曾興;張林;劉顯君;翁建峰;張佩
• 申請（專利權）人: 曾興
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種轉精氨酸酶基因玉米育種方法，其包括如下步驟：

（1）以pCAMBIA5300-ubi-Tnos為基礎載體，去除原來載體的HPT基因，換上了來自NK603中35S驅動的CP4EPSPS基因，將精氨酸酶基因ZmArg、異戊烯基轉移酶基因ZmIPT2和細胞壁轉化酶基因ZmMn1插入多克隆位點SmaⅠ之后，構建單子葉植物超量表達載體；

（2）單子葉植物超量表達載體經三親雜交法將目的基因轉移至農桿菌，挑取單菌落，進行PCR鑒定得到目標農桿菌；

（3）試驗材料的準備:自交系玉米種子分別在60-80%酒精浸泡40s-50，0.05-0.15%升汞消毒8-12min，無菌水沖洗，然后將種子浸泡在無菌水中，置于37℃水浴中4～5h；

（4）農桿菌侵染萌動胚：在超凈臺里用解剖刀在玉米萌動胚的生長點處劃開1～3mm的口子，放入制備好的農桿菌工程菌液中浸染芽尖，26-30℃，200-240r/min振蕩20-28h，然后把種子放在MS固體培養基上共培養2-4d；

（5）移栽：用清水洗掉菌體，轉入2-6mg/LPPT的選擇培養基中培養7-10天，除去矮化、生長緩慢的植株，選擇正常的移栽到裝有滅菌蛭石的營養缽中；

（6）在轉化苗長到3-4葉期時，均勻噴灑合適濃度的草甘膦水溶液行篩選，存活植株長到5-6葉期時移栽到田間收獲目標玉米種。

2.根據權利要求1所述的育種方法，所述的ZmArg基因序列為SEQ?ID?NO.1。

3.根據權利要求1所述的育種方法，所述的步驟（1）具體步驟如下：

（1）用SacⅡ和AatⅡ雙酶切載體pCAMBIA5300去除潮霉素基因(HPT)后，將其左邊界(T-border)序列重組連接，連接產物轉化E.coli?DH5，挑取單菌落堿裂解法提取質粒，限制性內切酶酶切鑒定；

（2）將EPSPS基因與經AatⅡ酶切去除潮霉素基因的載體pCAMBIA5300后重組連接，產物轉化E．coli?DH5感受態細胞，挑取單菌落振蕩培養過夜并用堿裂解法提取質粒，限制性內切酶酶切鑒定和質粒PCR檢測；

（3）將擴增得到的ZmArg基因和經Sma?Ⅰ酶切后的線性中間載體；pCAMBIA5300-EPSPS重組連接，轉化E．coli?DH5感受態細胞，挑取單菌落震蕩培養過夜并用堿裂解法提取質粒；

（4）三親雜交法將目的基因轉移至農桿菌，挑取單菌落，進行PCR鑒定得到目標農桿菌。

4.根據權利要求1所述的育種方法，所述的自交系玉米種子選自KF298、KF513或K10。