[發明專利]一種促進細胞貼壁生長的材料及其制備方法

無效

• 申請號: 201310002168.1
• 申請日: 2013-01-05
• 公開（公告）號: CN103087976A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 高敏
• 申請（專利權）人: 高敏
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07;C12N5/077;C12N5/071
• 代理公司: 北京律誠同業知識產權代理有限公司 11006
• 代理人: 梁揮;鮑俊萍

技術領域

本發明涉及一種細胞培養材料及制備方法，尤其涉及一種使用貽貝粘蛋白為主要原料制備的促進細胞貼壁生長的材料及其制備方法。

背景技術

由于動物細胞具有合成和分泌復合蛋白質的能力，動物組織培養在生物技術工業上發揮重要作用。動物細胞培養中，多數細胞的生長具有貼壁依賴特性。涉及貼壁依賴性細胞的哺乳動物細胞培養和分析用容器通常由玻璃或聚合物構成，其經常需要額外的表面處理以允許細胞粘附到容器表面。表面處理方法通常包括物理方法和化學方法。物理處理主要是借助于容器表面的特性，采用射頻真空等離子體、直流輝光放電和微波等離子體處理等實現?；瘜W處理通常是在表面施加吸附層，通過吸附、接枝或等離子體聚合技術。改變表面自身組成和化學基團的表面處理已成功用于制備適于培養多種類型哺乳動物細胞的聚合物的固體基底。然而，使用某些類型的哺乳動物細胞如多能干細胞和人胚腎（HEK293）細胞時，弱粘附和培養方面有明顯的限制。

對于貼壁難度較大的細胞，在細胞加入培養容器之前，通過使用胞外基質蛋白、膠原蛋白、多聚賴氨酸、聚鳥氨酸或聚乙烯亞胺在固體基底表面制備吸附層來促進細胞粘附。然而，制備吸附層很耗時，并且通常得到非無菌的固體基底，其儲存壽命比裸露固體基底更短。

另外一種動物細胞的體外培養多采用含血清的培養基進行培養，但成本高，血清成分不明確，不利于下游產物純化，更重要的是，血清中含有的潛在的病毒（如瘋牛病毒）會帶來污染等缺點。在無血清的條件下培育的哺乳類動物細胞會喪失細胞貼壁特性，在培養基要添加例如粘連蛋白、胰島素或轉鐵蛋白等促進細胞貼壁的成分，否則細胞容易地從載體中脫落下來而無法生長與存活。

中國專利公開號CN1391604中公開了一種用于培養哺乳動物細胞的無血清培養基，該培養基增加大豆水解產物作為無血清動物細胞培養組成，能夠起到提高被培養細胞培養穩定性、提高終細胞密度的作用。但大豆水解產物中除蛋白外還含有其他成分，影響細胞的增殖和生長，且給被培養細胞下游產品的分離帶來困難。

綜上所述，如何制備一種可促進細胞貼壁生長的材料，使其可適用于貼壁難度較高的細胞培養并且可以克服上述現有技術的缺點（制備耗時長、適用性差、成本高、下游產品分離困難等），是本領域亟待解決的問題。

另外，中國專利公開號（CN101348520、CN101348518、CN101585874）以及PCT國際申請號（PCT/CN2012/073167）中所公開的幾種分離純化貽貝粘蛋白的方法，均屬于本發明記載的內容。

發明內容

本發明的目的在于提供一種促進細胞貼壁生長的材料及其制備方法，其不但能使細胞快速貼壁、爬行、生長，還具有常溫保存、可整體滅菌、操作簡易、成本低等優點。

為實現上述目的，本發明提供一種促進細胞貼壁生長的材料，包括：可用于細胞培養的固體基質；以及可貼附于該固體基質上的貽貝粘蛋白。

其中，該貽貝粘蛋白于該固體基質上的分布濃度為0.1μg/cm²-1mg/cm²。

其中，該固體基質為培養容器或懸浮培養載體。

其中，該培養容器為培養板、培養瓶、培養皿或細胞培養反應的插件等。

其中，該懸浮培養載體為微載體、微球或膜片等。

本發明提供一種促進細胞貼壁生長的材料的制備方法，包括以下步驟：

(a)提供一可用于細胞培養的固體基質及一貽貝粘蛋白；

(b)將該貽貝粘蛋白配制成一定濃度的溶液，加入到步驟(a)中的該固體基質中，并將其干燥，即形成該促進細胞貼壁生長的材料。

其中，該貽貝粘蛋白可以是溶液也可以是干粉。

其中，該貽貝粘蛋白溶液由酸性、中性或弱堿性溶劑配制。

其中，該貽貝粘蛋白于該固體基質上的分布濃度為0.1μg/cm²-1mg/cm²。

其中，該固體基質為一培養容器或懸浮培養載體。

其中，該培養容器為培養板、培養瓶、培養皿或細胞反應器插件。

其中，該懸浮培養載體為微載體、微球或膜片等。

其中，步驟(b)的干燥方式采用室溫晾干或烘干，烘干溫度應不使固體基質破壞。

本發明提供一種促進細胞貼壁生長的材料的制備方法，包括以下步驟：

(a)提供一可用于細胞培養的固體基質及一貽貝粘蛋白；