[發(fā)明專利]一種“妃子笑”荔枝品種離體再生的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310001887.1
• 申請(qǐng)日: 2013-01-05
• 公開（公告）號(hào): CN103053420A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李煥苓;王果;王家保;張新春;孫進(jìn)華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;王慧鳳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及‘妃子笑’荔枝品種離體再生的方法，具體的，本發(fā)明涉及‘妃子笑’荔枝品種從愈傷組織誘導(dǎo)經(jīng)體胚發(fā)生途徑，發(fā)育成完整離體再生植株的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

荔枝(Litchi?chinensis?Sonn.)是我國(guó)南方主要的熱帶南亞熱帶果樹，在熱帶農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位，是農(nóng)民收入來源的重要組成部分。隨著人們生活水平的日益提高，對(duì)商品價(jià)值的追求也越來越高，加快荔枝育種技術(shù)與新品種培育的需求已迫在眉睫。荔枝童期長(zhǎng)，遺傳組成高度雜合，傳統(tǒng)的育種技術(shù)來改良荔枝性狀及培育新品種費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、困難大，已經(jīng)不能滿足荔枝產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需要。而分子克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)日漸成熟，采用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種有定向改良、擴(kuò)展育種范圍和縮短育種年限等特點(diǎn)。

自1983年傅蓮芳等報(bào)道荔枝組織培養(yǎng)獲得完整植株以來，研究者陸續(xù)進(jìn)行了組織培養(yǎng)研究，但是，進(jìn)展比較緩慢。目前荔枝生物技術(shù)育種的瓶頸在于未能建立起高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，而建立荔枝離體再生體系是高效遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的前提和基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種妃子笑荔枝品種離體再生的方法。該方法通過優(yōu)化愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組分、體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的培養(yǎng)基組分，特別是激素的選擇和濃度，同時(shí)優(yōu)化了培養(yǎng)條件，獲得了很高的愈傷組織誘導(dǎo)率和體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)效率。

本發(fā)明所提供的荔枝妃子笑品種離體再生的方法，包括下述步驟：

1)以荔枝妃子笑品種花藥為外植體，將外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，篩選得到胚性愈傷組織；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為3mg/L的2，4-D、終濃度為0.5mg/L的6-BA、終濃度為0.5mg/L的NAA、終濃度為30g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基或者M(jìn)S培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為1mg/L的2，4-D、終濃度為1mg/L的6-BA、終濃度為1mg/L的NAA、終濃度為30g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選為MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為3mg/L的2，4-D、終濃度為0.5mg/L的6-BA、終濃度為0.5mg/L的NAA、終濃度為30g/L的蔗糖和終濃度為7g/L的瓊脂，滅菌后，調(diào)節(jié)PH值至5.8獲得的培養(yǎng)基或者M(jìn)S培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為1mg/L的2，4-D、終濃度為1mg/L的6-BA、終濃度為1mg/L的NAA、終濃度為30g/L的蔗糖和終濃度為7g/L的瓊脂，滅菌后，調(diào)節(jié)PH值至5.8獲得的培養(yǎng)基；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件是23-27℃暗培養(yǎng)15-30天。

2)對(duì)步驟1)獲得的愈傷組織進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)得到體細(xì)胞胚；所述體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為5mg/L的KT、終濃度為0.1mg/L的NAA、終濃度為100mg/L的肌醇、終濃度為50g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基或者M(jìn)S培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為5mg/L的ZT、終濃度為0.1mg/L的NAA、終濃度為100mg/L的肌醇、終濃度為50g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基；所述體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基優(yōu)選為MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為5mg/L的KT、終濃度為0.1mg/L的NAA+終濃度為100mg/L的肌醇+終濃度為50g/L的蔗糖和終濃度為10g/L的瓊脂，滅菌調(diào)節(jié)pH至5.8獲得的培養(yǎng)基或者即MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為5mg/L的ZT、終濃度為0.1mg/L的NAA、終濃度為100mg/L的肌醇、終濃度為50g/L的蔗糖和終濃度為10g/L的瓊脂；所述體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件是23-27℃暗培養(yǎng)30-45天；

3)對(duì)步驟2)獲得的體細(xì)胞胚進(jìn)行成熟培養(yǎng)獲得成熟的細(xì)胞胚；所述成熟培養(yǎng)的培養(yǎng)基為50ml/L的椰乳、終濃度為60g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基；所述成熟培養(yǎng)的培養(yǎng)基優(yōu)選為50ml/L的椰乳、終濃度為60g/L的蔗糖和終濃度為10g/L瓊脂，滅菌，調(diào)pH至5.8獲得的培養(yǎng)基；所述成熟培養(yǎng)的條件為溫度23-27℃，光照培養(yǎng)。椰乳(或者椰汁)為新鮮椰子倒出的經(jīng)雙層紗布過濾后得到的椰子水。

4)對(duì)步驟3)獲得的成熟的細(xì)胞胚進(jìn)行再生培養(yǎng)，再生培養(yǎng)的培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為30g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基，優(yōu)選為在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為30g/L的蔗糖和終濃度為7g瓊脂，滅菌，調(diào)pH至5.8獲得的培養(yǎng)基；再生培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為溫度23-27℃，光照培養(yǎng)。