[發明專利]南美白對蝦桃拉病毒和白斑病毒多重PCR檢測方法

無效

• 申請號: 201310001706.5
• 申請日: 2013-01-05
• 公開（公告）號: CN103060471A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 金立方;余招鋒;倪堅
• 申請（專利權）人: 紹興文理學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 紹興市越興專利事務所 33220
• 代理人: 蔣衛東

技術領域

本發明涉及一種南美白對蝦桃拉病毒和白斑病毒多重PCR檢測方法，屬于微生物檢測方法技術領域。

背景技術

我國沿海地區是南美白對蝦養殖的主要產業區，在人工養殖環境中，對蝦可同時感染幾個病原體或病毒。優質的南美白對蝦親蝦及蝦苗主要從國外引進，但也有可能將潛在的病毒帶入境內。桃拉綜合癥病毒（Taura?syndrome?virus,?TSV）和白斑癥（White?spot?syndrome?virus,?WSSV）一直是對蝦養殖中的主要病毒原。近年來，隨著對蝦蝦苗和水產品國際貿易增加，這兩種病毒的混合交叉感染較為普遍，因此對該病毒的進行檢測與監控具有十分重要的意義。

對蝦病病毒檢測的方法包括組織學，原位雜交法，以及生物活性法，這些方法較為費時費工；而且往往只能適用于發生急性感染的蝦只，而病毒攜帶的對蝦往往不出現應有的臨床癥狀和病理反應，因此使用上述方法存在一定的局限性，加大了檢測的難度。RT-PCR技術是一種簡易有效的檢測方法，但是傳統的PCR方法一次只能檢測一個樣本。多重PCR是一種特殊的PCR方法，能在一個反應體系中加入多對引物，同時擴增多個目的片段。但是多重PCR檢測方法受多種因素影響，如引物的特異性、模板的質量以及不同病毒樣本PCR的擴增條件均能影響檢測的靈敏度和準確性。

有基于此，做出本發明。

發明內容

本發明的目的是提供一種特異性高、靈敏度高的高效南美白對蝦TSV和WSSV多重PCR檢測方法。

本發明采取的技術方案如下：

南美白對蝦TSV和WSSV多重PCR檢測方法，包括如下步驟：

（1）樣品采集；

（2）TSV的DNA和WSSV的RNA的提取，以及WSSV的逆轉錄cRNA的合成；

（3）TSV引物和WSSV引物的設計與合成；

（4）將步驟（2）的核酸和步驟（3）的引物加入PCR反應體系，建立PCR反應體系，并進行多重PCR試驗；

（5）將步驟（4）的擴增產物進行特異性和敏感性測試。

本發明的進一步設置如下：

步驟（1）中樣品要在-80℃下進行預處理。

步驟（2）中，TSV的RNA的提取：取疑似TSV發病對蝦內臟組織約0.1g，加入1ml?Trizol,?在4℃下12000g離心10min，得上清液;將上清液在15～30℃孵育5min;?加入0.2mL氯仿，振蕩、孵育;?在4℃下12000g離心15min；將離心后的上層無色水相加入0.5mL異丙醇，震蕩，孵育10min;?在4℃下12000g離心10min，去上清，加入至少1mL75%乙醇，渦旋振蕩;?在4℃下7500g離心5min，室溫晾干RNA，加入無RNase的水溶解RNA，55一60’C孵育10min,?溶解，備用。

步驟（2）中，TSV的cDNA的合成：在PCR反應管中加入5μL的上述桃拉病毒RNA模板，加入隨機引物10～20ng,?70℃孵育5min后，依次加入4μL?5×M-MLV?Buffer，RNA酶抑制劑和dNTP各1μL，M-MLV酶1μL，最后雙蒸水補足20μL；42℃反應1h，然后70℃滅活M-MLV酶10min，立即冰浴10min，得到cDNA，保存于－80℃備用。

步驟（2）中，WSSV的DNA的提取：取疑似WSSV發病對蝦內臟組織共約0.1g，加入200μL裂解液(0.4M?NaCl，10mM?Tris-HCl,?2mM?EDTA,?PH?8.0)?研磨均勻后補加100μL裂解液，6000g?離心去雜質及細胞碎片，取上清液；在上清液中加入30μL?20%SDS和3μL?20mg/mL蛋白酶K混合均勻，在55℃溫度下培育1～2h后，加入苯酚/氯仿/異戊醇（質量比為25:24:1）混合液，去除殘余蛋白，離心后取上清；加入與苯酚/氯仿/異戊醇混合液等體積的異丙醇，并混勻，-20℃下沉淀30min，10000g在4℃離心10min，加75%乙醇沉淀；得到的DNA溶于20μL雙蒸水中，并于-20℃備用。

步驟（3）中，TSV?RT-PCR檢測用的引物：5'-GCTTGCGTGGTGGGACTTA-3'，5'-TCAATGAGAGCTTGGTCCTGG-3'；WSSV?PCR檢測用的引物：5’-TCACAGGCGTATTGTCTCTCCT?-3’，5’?-?CACGAG?TCTACCGTCACAACATC?-3’。