[發明專利]一株高效轉化甲醇生產單細胞蛋白的畢赤酵母及其應用

有效

• 申請號: 201310001655.6
• 申請日: 2013-01-05
• 公開（公告）號: CN103045494A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 喬國厚;王蘭甫;茍萬曉;胡元森;張寅;曹敏;樊崇;張國杰;許宗浩;衛紅偉;田亞鵬;朱廣有;王霞
• 申請（專利權）人: 義馬煤業集團煤生化高科技工程有限公司
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12N1/00;C12R1/84
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113
• 代理人: 宋金鼎

1.一株高效轉化甲醇生產單細胞蛋白的畢赤酵母，其特征在于，分類命名為巴斯德畢赤酵母HGD-01，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC?NO:M2012342。

2.權利要求1所述的一株高效轉化甲醇生產單細胞蛋白的畢赤酵母的應用，其特征在于，具體步驟如下：

（1）、利用巴斯德畢赤酵母HGD-01菌株生產單細胞蛋白的方法：

一級種子的培養：將巴斯德畢赤酵母HGD-01的菌株用劃線法接種至YPD試管斜面培養基上，30℃培養48小時，得斜面種子，取2支培養好的斜面種子，每支用10mL無菌水將斜面種子全部沖洗下來，分別接種到2個裝250mL?YPD液體培養基的2L三角瓶中，28-32℃搖床中200-300rpm振蕩培養25-35小時，得一級種子；所述的YPD試管斜面培養基是由重量計的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂和余量的水混合在一起組成；所述的YPD液體培養基是由重量計的1%酵母浸膏、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖和余量的水混合在一起組成；

二級種子培養：在50L發酵罐中加入YPD液體培養基30L和二甲基硅油20mL，通入蒸汽對罐內培養基進行滅菌，滅菌溫度為121℃，時間為30min，在對YPD液體培養基滅菌的同時，對空氣過濾器和取樣品也進行滅菌，滅菌結束后，用冷卻水進罐體夾套對培養基進行降溫，待溫度降至30～35℃后，將培養好的500-600mL一級種子全部接入罐內YPD液體培養基中進行培養，培養條件為：培養溫度30-32℃，通氣量1.5～2vv/m，轉速200-300rpm，培養24～30小時后，菌體OD₆₀₀值達到40~45，得二級種子；

（2）、無機鹽培養基的制備：

無機鹽培養基的配制：先在發酵罐中加入1m³水，然后稱取以下各物質并依次加入到發酵罐中攪拌溶解：質量濃度為85%磷酸25kg/m³，磷酸氫二鉀0.5kg/m³，氯化銨0.3kg/m³，二水硫酸鈣0.2kg/m³，氯化鈉0.5kg/m³，硫酸鉀3kg/m³，七水硫酸鎂2kg/m³，甘油25kg/m³，微量元素溶液4L/m³；所述的微量元素溶液是由五水硫酸銅1.5g/L，碘化鉀0.02g/L，一水硫酸錳0.5g/L，二水鉬酸鈉0.2g/L，硼酸0.02g/L，六水合氯化鈷0.3g/L，氯化鋅20g/L，七水合硫酸亞鐵19g/L，質量濃度為98%的硫酸4mL/L，生物素0.2g/L，對氨基苯甲酸0.05g/L和泛酸鈣0.05g/L加水制成，也就是說微量元素溶液為五水硫酸銅1.5g，碘化鉀0.02g，一水硫酸錳0.5g，二水鉬酸鈉0.2g，硼酸0.02g，六水合氯化鈷0.3g，氯化鋅20g，七水合硫酸亞鐵19g，質量濃度為98%的硫酸4mL，生物素0.2g，對氨基苯甲酸0.05g和泛酸鈣0.05g加水至1?L；；

（3）、巴斯德畢赤酵母HGD-01菌株在5m³發酵罐中高密度發酵：

巴斯德畢赤酵母HGD-01菌株在5m³發酵罐中采用上述無機鹽培養基進行菌體蛋白生產：其中，罐中無機鹽培養基裝液量為2.5m³，用160℃以上的蒸汽對其進行滅菌，同時對接種管道、氨水及甲醇流加管道、取樣口管道、空氣過濾器進行滅菌，滅菌結束后用冷卻循環水對無機鹽培養基進行降溫，當罐內無機鹽培養基溫度降至30～35℃時，用質量濃度為35%的氨水調節無機鹽培養基pH至4.5～5.0，然后將二級種子30L全部接種到5m³發酵罐內pH為4.5～5.0的2.5m³無機鹽培養基中進行發酵，發酵溫度為30～32℃，通氣量1.5～2vv/m，攪拌轉速80-200rpm，24小時后，無機鹽培養基中甘油耗盡，溶氧開始上升，開始流加甲醇，用甲醇檢測儀器在線監測甲醇濃度，甲醇濃度控制在0.8%～1.2%，每6個小時取樣測定菌體OD₆₀₀值和濕重，45-50小時后，菌體濕重達到250-300?g/L，OD₆₀₀值達到42～45，此時發酵結束，收集發酵液；

（4）、將5m³發酵罐中的發酵液在30m³發酵罐中高密度發酵，30m³發酵罐中用的發酵培養基與5m³發酵罐中的發酵培養基相同，均為無機鹽培養基，配制方法同步驟（2）：

30m³發酵罐中裝無機鹽培養基20m³，用同（3）步驟中的滅菌方法滅菌結束后，用質量濃度為35%的氨水調節無機鹽培養基pH至4.5-5.0，將5m³發酵罐中的發酵液在發酵結束前12小時移種1m³到30m³發酵罐內的無機鹽培養基中進行發酵，發酵溫度30～32℃，控制罐內無機鹽培養基中溶氧為30-50%，攪拌轉速100-150rpm，當無機鹽培養基中甘油消耗完后溶氧快速上升，溶氧達到70%以上時開始流加甲醇，流加甲醇速度為5L/h/m³，當菌體濕重達到125g/L后，甲醇流加速度為12～15L/h/m³，發酵54～60小時后，菌體濕重達到380～450g/L，發酵終止；

（5）、甲醇蛋白提取：

將上述（4）步驟在30m³發酵罐中獲得的發酵液經臥式離心機，離心機轉速3000轉/分鐘，進料量5噸/小時，連續離心濃縮獲得濃縮的菌體蛋白液，濃縮的菌體蛋白液收集到5m³發酵液儲罐中，向儲罐中加入1m³的清水，攪拌均勻，經噴霧干燥機進行噴霧干燥，調節進風口溫度至140～160℃、出口溫度至65-80℃，調節進料流量為1噸/小時，收集蛋白干粉。

3.根據權利要求2所述的一株高效轉化甲醇生產單細胞蛋白的畢赤酵母的應用，其特征在于，具體步驟如下：

（1）、一株高效轉化甲醇生產單細胞蛋白的畢赤酵母，是分類命名為巴斯德畢赤酵母HGD-01的菌株，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC?NO:M2012342；

（2）、利用巴斯德畢赤酵母HGD-01菌株生產單細胞蛋白的方法：

一級種子的培養：將巴斯德畢赤酵母HGD-01的菌株?0.5mL用劃線法接種至YPD試管斜面培養基上，30℃培養48小時，取2支培養好的斜面種子，每支用10mL無菌水將斜面種子全部沖洗下來，分別接種到2個裝250mL?YPD液體培養基的2L三角瓶中，置于30℃，220rpm的搖床中振蕩培養約25小時，菌體OD₆₀₀達到3～4，即為一級種子；

二級種子培養：在50L發酵罐中加入30L的YPD液體培養基，20mL二甲基硅油作消泡劑，通入蒸汽對罐內培養基進行滅菌，滅菌溫度為121℃，時間為30min，在對YPD液體培養基滅菌的同時，對空氣過濾器和取樣品也進行滅菌，滅菌結束后，用冷卻水進罐體夾套對培養基進行降溫，待溫度降至30～35℃后，將2瓶共500mL的一級種子接種至發酵罐中的YPD液體培養基中，培養條件為：培養溫度32℃，通氣量1.5～2vv/m，轉速300rpm，培養24~30小時后，菌體濕重達到30~35g/L，OD₆₀₀值達到40~45，得二級種子；

（3）、巴斯德畢赤酵母HGD-01菌株在5m³發酵罐中高密度發酵：

巴斯德畢赤酵母HGD-01菌株在5m³發酵罐中采用無機鹽培養基進行菌體蛋白生產：其中，罐中無機鹽培養基裝液量為2.5m³，用160℃以上的高溫蒸汽對其進行滅菌，同時對接種管道、氨水及甲醇流加管道、取樣口管道、空氣過濾器進行滅菌，滅菌結束后用冷卻循環水對無機鹽培養基進行降溫，當罐內無機鹽培養基溫度降至30～35℃時，用質量濃度為35%的氨水調節無機鹽培養基pH至4.5～5.0，然后將二級種子30L全部接種到5m³發酵罐中進行發酵，發酵溫度為30～32℃，通氣量1.5～2vv/m，攪拌轉速80-200rpm，24小時后，無機鹽培養基中甘油耗盡，溶氧開始上升，開始流加甲醇，用甲醇檢測儀器在線監測甲醇濃度，發酵液中甲醇濃度控制在0.8%～1.2%，每6個小時取樣測定菌體OD₆₀₀值和濕重，45-50小時后，菌體濕重達到250-300?g/L，OD₆₀₀值達到42～45，此時發酵結束，收集發酵液；

（4）、將5m³發酵罐中的發酵液在30m³發酵罐中高密度發酵，30m³發酵罐中用的發酵培養基與5m³發酵罐中的發酵培養基相同，均為無機鹽培養基，配制方法同上：

30m³發酵罐中裝無機鹽培養基20m³，用同（3）步驟中的滅菌方法滅菌結束后用質量濃度為35%的氨水調節無機鹽培養基pH至4.5-5.0，將5m³發酵罐中的發酵液在發酵結束前12小時移種1m³到30m³發酵罐內的無機鹽培養基中進行發酵，發酵溫度30～32℃，控制罐內培養液溶氧為30-50%，攪拌轉速100-150rpm，當無機鹽培養基中甘油消耗完后，溶氧快速上升，溶氧達到70%以上時開始流加甲醇，流加甲醇速度為5L/h/m³，當菌體濕重達到125g/L后，甲醇流加速度增加到12～15L/h/m³，發酵54～60小時后，菌體濕重達到380～450g/L，鏡檢觀察發現菌體個大，內容物較多，出芽數量較少，發酵終止；

（5）、甲醇蛋白提取：

將上述（4）步驟在30m³發酵罐中獲得的發酵液經臥式離心機，離心機轉速3000轉/分鐘，進料量5噸/小時，連續離心濃縮獲得濃縮的菌體蛋白液，濃縮的菌體蛋白液收集到5m³發酵液儲罐中，向儲罐中加入1m³的清水，攪拌均勻，經噴霧干燥機進行噴霧干燥，調節進風口溫度至140～160℃、出口溫度至65-80℃，調節進料流量為1噸/小時，收集蛋白干粉，稱重，25公斤/袋，包裝。