[發(fā)明專利]一種MnSOD-Hemolin融合蛋白及其結(jié)晶方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310001456.5
• 申請(qǐng)日: 2013-01-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103060280A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張耀洲;杜瑤瑤;劉玲玲;王鑒;陳劍清;舒特俊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津耀宇生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/02
• 分類號(hào): C12N9/02;C12N15/70
• 代理公司: 北京匯澤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11228
• 代理人: 張瑾

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)和蛋白質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種MnSOD-Hemolin融合蛋白及其結(jié)晶方法。

背景技術(shù)

蛋白結(jié)晶技術(shù)的發(fā)展是本世紀(jì)的重要項(xiàng)目，不僅僅對(duì)研究蛋白尤其是膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有作用，還在病毒學(xué)中有著一定的應(yīng)用。但是現(xiàn)有的蛋白結(jié)晶技術(shù)，不但要求蛋白具有活性而且必須具有很高的純度，其蛋白的結(jié)晶條件也很難摸索。已有文獻(xiàn)報(bào)道運(yùn)用共結(jié)晶技術(shù)可以幫助某些蛋白的結(jié)晶，且MnSOD的結(jié)晶技術(shù)已經(jīng)很成熟，故可利用MnSOD-Hemolin的共結(jié)晶對(duì)Hemolin結(jié)晶條件進(jìn)行探索。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種MnSOD-Hemolin融合蛋白及其結(jié)晶方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種MnSOD-Hemolin融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種上述MnSOD-Hemolin融合蛋白的結(jié)晶方法，所述方法包括以下步驟：?

1)?Hemolin基因的獲得；

2)重組表達(dá)載體pET-28a-MnSOD-Hemolin的構(gòu)建；

3)重組蛋白的表達(dá)；

4)重組蛋白的初步純化；

5)重組目的蛋白的進(jìn)一步純化；

6)重組目的蛋白的結(jié)晶。

優(yōu)選地，其中所述結(jié)晶方法包括以下步驟：?

1)通過(guò)設(shè)計(jì)引物，以家蠶蠶蛹cDNA為模板擴(kuò)增，獲得Hemolin基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示;

2)將步驟1)所得Hemolin基因連接到pET-28a-MnSOD載體中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-MnSOD-Hemolin；

3)將步驟2)所得重組表達(dá)載體pET-28a-MnSOD-Hemolin導(dǎo)入大腸桿菌BL21中，誘導(dǎo)表達(dá)獲得大量重組蛋白；

4)將步驟3)所得重組蛋白與鎳離子親和層析柱結(jié)合，然后用20mM/L的咪唑洗雜蛋白，200mM/L的咪唑洗脫重組目的蛋白；

5)將步驟4)所得重組目的蛋白濃縮后，利用superdex?75進(jìn)一步分離純化，得到較純的重組目的蛋白;

6)收集步驟5)中的第一個(gè)峰的所有溶液，并濃縮，將濃縮好的蛋白用于點(diǎn)晶。

優(yōu)選地，其中所述步驟1)中擴(kuò)增方法為PCR擴(kuò)增方法。

優(yōu)選地，其中所述步驟3)中，將步驟2)所得重組表達(dá)載體pET-28a-MnSOD-Hemolin轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組基因工程菌pET-28a-MnSOD-Hemolin，將該重組基因工程菌pET-28a-MnSOD-Hemolin在在含50?mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中于37℃，220?rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5時(shí)，加終濃度為1mM?的IPTG，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，獲得大量重組目的蛋白。

優(yōu)選地，其中所述步驟4)中，將步驟3)所得基因重組工程菌pET-28a-MnSOD-Hemolin擴(kuò)大培養(yǎng)，之后于4℃下6000rpm離心30min，棄去培養(yǎng)基，沉淀即為菌體，然后超聲破碎，于4℃下12000rpm離心30min，分為沉淀和上清，將含有目的蛋白的上清溶液過(guò)0.45μm纖維素膜過(guò)濾后，與鎳離子親和層析柱結(jié)合，然后用20mM/L的咪唑溶液洗雜蛋白，200mM/L的咪唑溶液洗脫目的蛋白。

優(yōu)選地，其中所述步驟4)中，將步驟3)所得重組目的蛋白通過(guò)0.45μm纖維素膜過(guò)濾后，與鎳離子親和層析柱結(jié)合，然后用20mM/L的咪唑溶液洗雜蛋白，200mM/L的咪唑溶液洗脫目的蛋白。

優(yōu)選地，其中所述步驟5)中，將步驟4)所得目的蛋白經(jīng)過(guò)50kD的超濾管濃縮，利用Superdex?75進(jìn)一步分離純化，得到較純的目的蛋白。

優(yōu)選地，其中所述步驟6)中點(diǎn)晶具體包括：

(1)對(duì)24孔晶體培養(yǎng)板上的小孔進(jìn)行編號(hào)，每一個(gè)編號(hào)小孔對(duì)應(yīng)一個(gè)的蛋白結(jié)晶試劑盒篩選的條件，每個(gè)小孔中依次加入200?μL不同試劑盒中不同條件的結(jié)晶緩沖液，參考MnSOD-Hemolin的蛋白性質(zhì)預(yù)測(cè)信息，共使用了500個(gè)蛋白結(jié)晶的條件；

(2)用結(jié)晶專用移液器吸取1?μL純化后的目的蛋白樣品，然后滴在硅化蓋玻片上，每個(gè)蓋玻片上點(diǎn)3個(gè)不同濃度的目的蛋白樣品；同時(shí)要在每個(gè)點(diǎn)好的目的蛋白樣品中滴入1?μL的結(jié)晶緩沖液，將其混勻；