[發(fā)明專(zhuān)利]表達(dá)重組人腫瘤壞死因子受體-Fc融合蛋白基因的家蠶重組桿狀病毒及其制備方法和應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310001030.X
• 申請(qǐng)日: 2013-01-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103131676A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張耀洲;南芙蓉;張浩;舒特俊;陳劍清
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 天津耀宇生物技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N7/01
• 分類(lèi)號(hào): C12N7/01;C12N15/62;C12N15/866;C07K19/00;C12R1/93
• 代理公司: 北京匯澤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11228
• 代理人: 張瑾

1.一種表達(dá)重組人腫瘤壞死因子受體-Fc融合蛋白基因的家蠶重組桿狀病毒，其特征在于，該病毒含有重組人腫瘤壞死因子受體-Fc融合蛋白基因。

2.如權(quán)利要求1所述的家蠶重組桿狀病毒，其特征在于，所述重組人腫瘤壞死因子受體-Fc融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

3.一種權(quán)利要求1或2所述家蠶重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)重組人腫瘤壞死因子受體-Fc融合蛋白基因的合成；

(2)將步驟(1)所合成的重組人腫瘤壞死因子受體-Fc融合蛋白基因連接到轉(zhuǎn)移載體上，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體；

(3)將步驟(2)?構(gòu)建的重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，得到重組桿狀病毒DNA；

(4)將步驟(3)得到的重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，得到家蠶重組桿狀病毒。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)具體包括：?

采用pUC57-rhTNFR-Fc重組載體為模板，以SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得重組人腫瘤壞死因子受體-Fc融合蛋白基因rhTNFR-Fc。

5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)具體包括：?

將PCR擴(kuò)增得到的重組人腫瘤壞死因子受體-Fc融合蛋白基因用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后回收，通過(guò)用T4連接酶連接到經(jīng)同樣處理的轉(zhuǎn)移載體pFastBac1上，使重組人腫瘤壞死因子受體-Fc融合蛋白基因位于多角體基因啟動(dòng)子控制之下，然后轉(zhuǎn)化到Trans10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆，得到重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-rhTNFR-Fc。

6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)具體包括：?

將步驟(2)得到的重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-rhTNFR-Fc轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、X-gal和IPTG的LB培養(yǎng)板上避光培養(yǎng)40-48?h后挑取白斑，培養(yǎng)16-20?h后菌液稀釋10⁶重新涂板做篩選，挑取白斑至LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖菌培養(yǎng)16-20?h后，用異丙醇抽提重組桿狀病毒DNA，并用M13通用引物做PCR鑒定。

7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)具體包括：?

取步驟(3)鑒定成功的重組桿狀病毒DNA通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，發(fā)病后獲得零代病毒懸液0-4℃保存，提取病毒基因組用M13通用引物進(jìn)行PCR鑒定，獲得家蠶重組桿狀病毒vBm-rhTNFR-Fc。

8.一種權(quán)利要求1所述家蠶重組桿狀病毒表達(dá)的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。

9.一種權(quán)利要求8所述融合蛋白的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)將權(quán)利要求1-2任一所述的家蠶重組桿狀病毒感染家蠶BmN細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增，并做細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物的鑒定；

(2)將步驟(1)中擴(kuò)增得到的F4代病毒用穿刺接種法接種家蠶五齡幼蟲(chóng)，收集發(fā)病蠶血；

(3)從步驟(2)收集的蠶血中純化出權(quán)利要求8所述融合蛋白。