[發(fā)明專利]酶方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201280069777.2
• 申請日: 2012-12-28
• 公開（公告）號: CN104126018B
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 露絲·莫伊西;安德魯·約翰·赫倫;紹博爾奇·蘇羅爾斯
• 申請（專利權(quán)）人: 牛津納米孔技術(shù)公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 北京同立鈞成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11205
• 代理人: 臧建明

1.一種表征目標(biāo)多核苷酸的方法，包括:

(a)將目標(biāo)多核苷酸與跨膜孔和RecD解旋酶接觸，使得所述目標(biāo)多核苷酸移動穿過所述孔并且使所述RecD解旋酶控制所述目標(biāo)多核苷酸穿過所述孔的移動；以及

(b)隨著所述多核苷酸相對所述孔移動獲取一個或多個測量值，其中所述測量值代表所述目標(biāo)多核苷酸的一個或多個特征并由此表征所述目標(biāo)多核苷酸，

其中所述方法使用0.3M-0.4M的鹽濃度進行實施；

其中所述跨膜孔選自溶血素,殺白細(xì)胞素,恥垢分枝桿菌孔蛋白A(MspA),外膜孔蛋白F(OmpF),外膜孔蛋白G(OmpG),外膜磷酯酶A,奈瑟氏菌自轉(zhuǎn)運脂蛋白(NalP)和WZA；并且

其中所述RecD解旋酶包括氨基酸模序X1-X2-X3-X4-X5-(X6)₃-Q-X7(SEQ ID NO:16)，其中X1為Y,W或F,X2為A,T,S,M,C或V,X3為任意氨基酸,X4為T,N或S,X5為A,T,G,S,V或I,X6為任意氨基酸且X7為G或S。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述一個或多個特征選自(i)所述目標(biāo)多核苷酸的長度，(ii)所述目標(biāo)多核苷酸的相似性，(iii)所述目標(biāo)多核苷酸的序列,(iv)所述目標(biāo)多核苷酸的二級結(jié)構(gòu)以及(v)所述目標(biāo)多核苷酸是否被修飾。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述目標(biāo)多核苷酸經(jīng)甲基化，氧化，損傷，用一個或多個蛋白質(zhì)，或用一個或多個標(biāo)記物，標(biāo)簽或間隔物進行修飾。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其中所述目標(biāo)多核苷酸的一個或多個特征通過電測量和/或光學(xué)測量進行測量。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述電測量為電流測量，阻抗測量，隧道測量或場效應(yīng)晶體管(FET)測量。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法包括：

(a)將目標(biāo)多核苷酸與跨膜孔和RecD解旋酶接觸，使得所述目標(biāo)多核苷酸移動穿過所述孔并且使所述RecD解旋酶控制所述目標(biāo)多核苷酸穿過所述孔的移動；和

(b)隨著所述多核苷酸相對所述孔移動測量穿過所述孔的電流，其中所述電流代表所述目標(biāo)多核苷酸的一個或多個特征并由此表征所述目標(biāo)多核苷酸。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(b)包括隨著所述多核苷酸移動穿過所述孔，獲取一個或多個測量值。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法進一步包括跨所述孔施加電壓到以在所述孔和解旋酶之間形成復(fù)合體的步驟。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中至少所述多核苷酸的一部分為雙鏈。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述跨膜蛋白由SEQ ID NO:2所示的8個相同亞基形成。

11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述跨膜蛋白為由SEQ ID NO:4所示的7個相同亞基形成的α-溶血素。

12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述RecD解旋酶包括：

-氨基酸模序X1-X2-X3-G-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO:8)，其中X1為G,S或A，X2為任意氨基酸，X3為P,A,S或G,X4為T,A,V,S或C,X5為G或A,X6為K或R且X7為T或S。