[發明專利]使用細菌細胞色素P450從奧美拉唑制備代謝物的新方法和用于其的組合物

有效

• 申請號: 201280068693.7
• 申請日: 2012-12-21
• 公開（公告）號: CN104105794B
• 公開（公告）日: 2016-10-26
• 發明（設計）人: 尹喆湖;柳相勛;姜馨植
• 申請（專利權）人: 尹喆湖
• 主分類號: C12P7/42
• 分類號: C12P7/42;C12N9/00
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司 11127
• 代理人: 龐東成;丁香蘭

技術領域

本發明涉及一種使用細菌細胞色素P450從奧美拉唑制備代謝物的新方法和用于該新方法的組合物，更具體而言，涉及用于從奧美拉唑制備5'-羥基產物的組合物和試劑盒及其制備方法，所述組合物和試劑盒含有細菌細胞色素P450BM3(CYP102A1)或其突變形式。

背景技術

奧美拉唑是質子泵抑制劑，已知其是消化不良、胃潰瘍、胃食管反流病和咽喉反流病的治療劑。奧美拉唑是外消旋體，含有比例為50:50的S和R對映異構體。在以上酸性條件下，這兩種對映異構體都轉化成非手性化合物，并且與H+/K+ATP酶的半胱氨酸基團反應，從而抑制胃壁細胞中的胃酸產生。奧美拉唑和對映異構體被存在于人肝臟中的細胞色素P450CYP2C19和CYP3A4代謝，其主要代謝物包括5'-O-脫甲基奧美拉唑、5'-和3'-羥基奧美拉唑以及奧美拉唑砜(參見Renberg等,Drug?Metab?Dispos?17:69-76,1989；Andersson等,Clin?Pharmacokinet?40:411-426,2001；Li等,J?Pharmacol?Exp?Ther?315:777-787,2005)。據報道，R對映異構體通常被CYP2C19代謝為5'-O-脫甲基奧美拉唑、5'-羥基奧美拉唑，S對映異構體通常被CYP3A4代謝為奧美拉唑砜、3'-羥基奧美拉唑。

細胞色素P450(P450或CYP)酶是個大家族，該家族由多種酶組成，這些酶充當從古細菌至細菌、真菌、植物、動物和人的整個自然界中的多種多樣的氧化反應的催化劑。由于催化功能的多樣性以及其底物范圍廣，P450可大規模地用作制備精細化工品(包括藥物供應等)時的生物催化劑(參見Guengerich,Nat?Rev?Drug?Discov1:359-366,2002；Urlacher等,Trends?Biotechnol24:324-330,2006；Yun?CH等,Trends?Biotechnol?25:289-298,2007；Lamb等,Curr?Opin?Biotechnol18:504-512,2007)。但是，雖然哺乳動物的細胞色素P450酶在各種上述生物技術領域中具有潛在的可用性，但是P450的穩定性、催化活性和可獲得性較低，因此不適合作為生物催化劑。

當在開發藥物期間人利用P450將前藥轉化為生物“活性代謝物”時(參見Johnson等,Breast?Cancer?Res.Treat85:151-159,2004)，需要大量的純代謝物來研究該藥物的功效、毒性和藥代動力學等。此外，當代謝物自身具有生物活性時，體內直接施用所述代謝物具有巨大裨益，因此大規模生產所述代謝物是重要的。

當將奧美拉唑施用至人體中時，由于奧美拉唑被CYP2C19和CYP3A4代謝，代謝物產生的速率會根據酶的表達程度而有所不同。另外，會出現藥物與被所述酶代謝的其他藥物相互作用的問題。因此，當將奧美拉唑代謝物直接用作藥物時，可以避免藥物相互作用問題。

但是，由于在化學合成純代謝物時存在各種問題，為了以替代代謝物化學合成的方式產生藥物代謝物或藥物候選物，使用了P450。已經報道了使用表達自大腸桿菌(參見Yun等,Curr?Drug?Metab7:411-429,2006)或昆蟲細胞(參見Rushmore等,Metab?Eng2:115-125,2000；Vail等,J?Ind?Microbiol?Biotechnol32:67-74,2005)的人P450來生產所述代謝物。但是，由于穩定性有限和反應速率低等原因，這些體系具有諸如成本昂貴和產生率低等問題(參見Guengerich等,Crit?Rev?Toxicol26:551-583,1996)。因此，已經提出了使用具有所需催化活性的工程化細菌P450酶作為用于產生人體中的代謝物的替代途徑的方法(參見Yun?CH等,Trends?Biotechnol25:289-298,2007)。