[發明專利]檢測核酸合成和/或擴增的方法

有效

• 申請號: 201280065871.0
• 申請日: 2012-11-29
• 公開（公告）號: CN104093856A
• 公開（公告）日: 2014-10-08
• 發明（設計）人: 瑪麗亞·埃琳娜·圖爾巴;埃莉薩·贊邦
• 申請（專利權）人: 基因迅捷有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/70
• 代理公司: 北京英特普羅知識產權代理有限公司 11015
• 代理人: 齊永紅

1.一種檢測靶核酸序列合成和/或擴增的方法，包括以下步驟：

(i)提供至少一組設計的用于在所述靶核酸序列的至少一個區域進行合成和/或擴增的引物；

(ii)將上述步驟(i)中的一組引物與所述靶核酸序列的至少一個區域擴增的反應混合物相結合，所述反應混合物包括至少一種比色金屬指示劑以及至少一種鎂螯合劑；

(iii)將從步驟(ii)中獲得的反應混合物與生物樣品相接觸，以擴增樣品中可能存在的靶核酸序列的至少一個區域；以及

(iv)檢測反應混合物可能的顏色變化。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述比色金屬指示劑選自：羥基萘酚藍、羊毛鉻黑T、8-羥喹啉+丁酰胺、鈦黃、二甲苯胺藍、鈣鎂試劑、二甲苯胺藍、百里酚藍、鉻菁R、茜素紅S、鄰甲酚酞、1,2,3-三羥基蒽醌、醌茜隱色體、醌茜素、對硝基苯-偶氮-對硝基苯-間苯二酚、丁酰胺、鉻變素2B、氨+酚酞、堿性次碘酸鹽、五次甲基巴比妥酸和二苯卡巴肼及它們的組合，所述比色金屬指示劑優選羥基萘酚藍。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述鎂螯合劑為溫和的鎂螯合劑，其選自：檸檬酸鈉、乙酸、ADP、天冬氨酸、ATP、正丁酸、檸檬酸、半胱氨酸、3,4-二羥基苯甲酸、O,O-二甲基紅棓酚、EDTA、EGTA、葡萄糖酸、谷氨酸、戊二酸、甘油酸、甘氨酸、羥基乙酸、雙甘氨肽、鳥苷、鄰羥基苯甲酸、次黃苷三磷酸、乳酸、蘋果酸、NTA、草酸、多磷酸鹽、丙酸、嘌呤、水楊醛、水楊酸、琥珀酸、酒石酸、四偏磷酸鹽、三偏磷酸鹽、三磷酸鹽、尿苷二磷酸及它們的組合，所述鎂螯合劑優選檸檬酸鈉。

4.根據權利要求1至3中的任意一項所述的方法，其特征在于：所述比色金屬指示劑和所述溫和的鎂螯合劑分別為羥基萘酚藍和檸檬酸鈉。

5.根據權利要求1至4中的任意一項所述的方法，其特征在于：所述反應混合物可能的顏色變化是從落在優選為藍紫色、淡紫色或紫紅色的紫羅蘭色范圍內的顏色，到落在優選為天藍色的藍色范圍內的顏色。

6.根據權利要求1至5中的任意一項所述的方法，其特征在于：核酸序列合成和/或擴增的方法為LAMP。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：所述步驟(i)包括以下步驟：

(a)在自3'末端啟動的靶核酸序列的3'區任意選擇序列F3c、序列F2c和F1c；

(b)在自5'末端啟動的靶核酸序列的5'區任意選擇序列B3、序列B2和B1；

(c)提供至少一組引物以對所述靶核酸序列采用LAMP進行擴增，所述引物組包括：

(c1)至少一對包括正向內引物(FIP)和反向內引物(BIP)的內引物，所述FIP包括與F2c互補的序列F2以及與F1互補的序列F1c，所述BIP包括與B2c互補的序列B2以及與B1互補的序列B1c；

(c2)至少一對包括與F3c互補的正向外引物(F3)以及與靶核酸序列的B3c區相對應的反向外引物(B3)的外引物。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：上述步驟(c)中的引物組還含有至少一對包括外環狀引物(LB)和內環狀引物(FB)的環狀引物。

9.根據權利要求1至8中的任意一項所述的方法，其特征在于：步驟(ii)中所述的反應混合物中含有濃度為1000至3000μM的羥基萘酚藍。

10.根據權利要求1至9中的任意一項所述的方法，其特征在于：所述方法用于檢測選自生物樣品中的支原體屬(Mycoplasma)、李斯特菌屬(Listeria)、細螺旋體屬(Leptospira)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、犬細小病毒(CPV)和貓細小病毒(FBV)中的至少一種病原體。