[發(fā)明專利]確定蕓苔中FAD3基因的接合性的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201280063464.6
• 申請日: 2012-10-19
• 公開（公告）號: CN104011225A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: L.C.尤巴亞塞納;Z.埃勒特;C.S.A.錢納巴薩瓦拉德亞;M.古普塔
• 申請（專利權(quán)）人: 陶氏益農(nóng)公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C07H21/04
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所 11105
• 代理人: 史悅

1.一種用于確定包含fad-3c基因的蕓苔植物的接合性的方法，所述方法包括：

自所述蕓苔植物獲得基因組DNA樣品；

通過使所述基因組DNA樣品與第一引物和第二引物接觸產(chǎn)生接觸樣品，其中所述第一引物優(yōu)先結(jié)合在感興趣的單核苷酸多態(tài)性位置上游的所述fad-3c基因的區(qū)域，所述第二引物優(yōu)先結(jié)合在感興趣的單核苷酸多態(tài)性位置下游的所述fad-3c基因的區(qū)域，其中所述第一引物和所述第二引物在受到聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)條件處理時生成擴增子；

使所述接觸樣品進行PCR條件處理，其中生成所述擴增子；

容許第一熒光探針和第二熒光探針中每種于50-70攝氏度的溫度與所述擴增子雜交一段時間，所述第一熒光探針在所述感興趣的單核苷酸多態(tài)性不存在于所述擴增子中時優(yōu)先與所述擴增子雜交，所述第二熒光探針在所述感興趣的單核苷酸多態(tài)性存在于所述擴增子中時優(yōu)先與所述擴增子結(jié)合；

在所述容許步驟中規(guī)定的時間段后提高所述溫度；

在提高步驟期間捕捉由所述第一和第二探針中每種產(chǎn)生的所述熒光；并

確定所述蕓苔植物的接合性，確定步驟包括比較由所述第一和第二探針中每種產(chǎn)生的所述熒光，其中主要反映純合SNP陽性對照樣品中產(chǎn)生的熒光的所述第一和第二探針的熒光指示所述感興趣的單核苷酸多態(tài)性的存在，主要反映純合SNP陰性對照樣品中產(chǎn)生的熒光的所述第一和第二探針的熒光指示所述感興趣的單核苷酸多態(tài)性的存在的缺乏，且主要反映雜合SNP陽性對照樣品中產(chǎn)生的熒光的所述第一和第二探針的熒光指示所述蕓苔植物包含含有所述感興趣的單核苷酸多態(tài)性的第一等位基因和缺乏所述感興趣的單核苷酸多態(tài)性的第二等位基因。

2.權(quán)利要求1的方法，其中所述擴增子由91-154個堿基對組成。

3.權(quán)利要求1的方法，其中所述單核苷酸多態(tài)性由G至A多態(tài)性組成。

4.權(quán)利要求3的方法，其中所述野生型序列包含所述位置處的鳥嘌呤(glysine)。

5.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法用于雜交育種蕓苔植物的育種漸滲確認(breeding?introgression?verification)。

6.權(quán)利要求1的方法，其中所述引物包含SEQ?ID?NO:2和SEQ?ID?NO:3，且所述第一和第二探針包含SEQ?ID?NO:5和4。

7.權(quán)利要求1的方法，其中用熒光染料和淬滅劑兩者標記所述第一和第二探針。

8.權(quán)利要求7的方法，其中所述第一探針包含在所述第一探針5’端作為所述熒光染料的FAM和在所述第一探針3’端的MGB淬滅劑(quencher)。

9.權(quán)利要求7的方法，其中所述第二探針在所述第二探針的5’端用VIC標記且在所述第二探針的3’端用MGB淬滅劑標記。

10.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二探針包含SEQ?ID?NO:4。

11.權(quán)利要求1的方法，其中在讀板儀中直接讀出所述方法的熒光結(jié)果。

12.權(quán)利要求1的方法，其中從田間的蕓苔植物獲得所述DNA樣品。

13.權(quán)利要求1的方法，其中所述提高步驟包括以每個時間段基本上一致的溫度增量提高所述溫度。

14.權(quán)利要求1的方法，其中在所述提高步驟的每個增量期間在所述捕捉步驟中捕捉所述提高步驟期間由所述第一和第二探針中每種產(chǎn)生的所述熒光。

15.一種用于實施權(quán)利要求1的方法的試劑盒，所述試劑盒包含所述第一引物、所述第二引物、所述第一探針、和所述第二探針。

16.權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述第一引物由SEQ?ID?NO:2組成，所述第二引物由SEQ?ID?NO:3組成，所述第一探針由SEQ?ID?NO:5組成，且所述第二探針由SEQ?ID?NO:4組成。