[發(fā)明專利]組合不同溫度步驟的核酸轉(zhuǎn)錄擴增方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201280062012.6
• 申請日: 2012-12-14
• 公開（公告）號: CN104105796B
• 公開（公告）日: 2018-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: A·拉尤;A·洛朗;L·梅斯塔
• 申請（專利權(quán)）人: 生物梅里埃公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 永新專利商標(biāo)代理有限公司 72002
• 代理人: 左路

本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)錄擴增方法，其中：a)使至少一種存在于生物學(xué)樣品中的靶核酸與以下化合物接觸：擴增引物，進行擴增需要的所有試劑，包括參與擴增的酶，以及至少一種用以穩(wěn)定實施擴增所需要酶的多元醇，b)在44℃以上的溫度加熱混合物，c)在44℃以上的溫度實施靶核酸轉(zhuǎn)錄擴增。本發(fā)明還涉及檢測通過擴增方法獲得的擴增子的方法，對待測靶核酸進行預(yù)處理的方法，以及體外診斷存在所述靶核酸的方法。本發(fā)明優(yōu)選應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域。

本發(fā)明涉及一種方法，其中通過轉(zhuǎn)錄擴增方法對存在于生物學(xué)樣品中的至少一種靶核酸進行擴增，所述方法可組合不同溫度的步驟，即本質(zhì)上是變性和擴增。

現(xiàn)有技術(shù)包括一些研究多元醇對酶熱穩(wěn)定化作用的科學(xué)論文。尤其是這些例子：

-Lee在1981年發(fā)表于J.Biol.Chemistry256(14)：7193-7201，題目為“蔗糖對蛋白的穩(wěn)定化”的論文，其描述了蔗糖對α-糜蛋白酶、糜蛋白酶原和RNA酶的熱穩(wěn)定化作用。

-Bernier在1988年發(fā)表于J.Biotechnol.7：293-298，題目為“多元醇對α-葡萄糖苷酶的穩(wěn)定化”的論文，證明多元醇對α-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定化作用。

-Carninci在1998年發(fā)表于Proc.Natl Acad.Sci.95：520-524，題目為“海藻糖對不耐熱酶的熱穩(wěn)定化和熱活化及其用于全長cDNA的合成的應(yīng)用”的論文，其提出海藻糖對逆轉(zhuǎn)錄酶和限制性內(nèi)切酶的熱穩(wěn)定化作用。

-Spiess在2004年發(fā)表于Clinical Chemistry50(7)：1256-1259，題目為“海藻糖是一種有效的PCR增強劑：二糖海藻糖降低DNA的解鏈溫度和熱穩(wěn)定化taq聚合酶”的論文，文中證明了海藻糖對Taq聚合酶的熱穩(wěn)定化作用。

因此，很明顯，大約三十年來，許多研究者對多元醇對酶的熱穩(wěn)定化作用感興趣。此外，十五年前提交的專利申請EP-A-0821058提供了一種用于在高溫下提高酶活性的方法。相應(yīng)的專利要求保護多元醇用于熱穩(wěn)定化聚合酶和限制性內(nèi)切酶的用途。

雖然科學(xué)家感興趣，但似乎沒有人嘗試在NASBA、TMA等的轉(zhuǎn)錄擴增中，采取這種方法。此類方法施行中，都要用到多種不同酶的活性。第一個步驟包括靶在65℃下進行2分鐘變性，所述靶為核酸，通常為核糖核酸(RNA)。第二個步驟自身包括添加需要的酶，用于在41℃下進行等溫擴增。由于要依次使用兩個溫度，這兩個步驟使得該方法對使用者而言存在技術(shù)上的局限性。

此外，使用單一溫度(41℃)目前造成了各種問題，比如，擴增富含鳥嘌呤和胞嘧啶的靶，后者具有難以擴增二級結(jié)構(gòu)。用轉(zhuǎn)錄擴增技術(shù)使這些二級結(jié)構(gòu)易于擴增的最熟知方法是在擴增混合物中使用第五種核苷酸，即三磷酸核糖核苷(K Nakahara et al.NucleicAcids Res 1 April1998，26(7)：.1854-1856)。

用核酸序列的擴增(NASBA)技術(shù)，易于使用脫氧核糖核酸(DNA)靶。要實現(xiàn)這些要做的就是，例如，預(yù)先將根據(jù)EP-B-0397269或?qū)＠暾圵O-A-02/070735的方法應(yīng)用于已處理的樣品，使DNA靶能夠進行擴增。

雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員用兩個具有不同溫度的步驟進行這類DNA靶的轉(zhuǎn)錄已經(jīng)幾十年了。但是他們還沒考慮到嘗試提高所用酶的熱穩(wěn)定性來減少此類轉(zhuǎn)錄擴增方法的局限性。

因此本發(fā)明描述了轉(zhuǎn)錄擴增方法的簡化，由于同時加入靶核酸和擴增試劑如緩沖液、酶或核苷酸，并存在熱穩(wěn)定化化學(xué)添加劑，該方法可在單一的步驟中實施，所述熱穩(wěn)定化化學(xué)添加劑使得使用更高擴增溫度(達到所述靶核酸變性步驟所使用的溫度)成為可能。這個效果是特別令人意想不到的且因此是令人驚訝的。

創(chuàng)新之處在于通過使用化學(xué)添加劑，例如多元醇，使T7RNA聚合酶，RNA酶H和AMV-RT的活性能夠在高于41℃的溫度能夠得到保護，從而使所有的酶活性，特別是在NASBA擴增法中3種酶活性同時熱穩(wěn)定化，進而使變性和擴增的實驗步驟能夠結(jié)合起來。