[發明專利]用于分離細胞外核酸的快速方法

在審

• 申請號: 201280055508.0
• 申請日: 2012-09-25
• 公開（公告）號: CN103930546A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 馬丁·霍利茨;安妮特·諾孔;馬庫斯·施普倫格-豪塞爾斯;彼得·格林菲爾德;克里斯托夫·埃爾巴赫
• 申請（專利權）人: 凱杰有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 張穎;謝麗娜

1.一種通過將細胞外核酸結合于帶有陰離子交換基團的固相以從樣品分離所述細胞外核酸的方法，所述方法包括下列步驟：

a.在結合混合物中將所述細胞外核酸結合于所述固相，所述結合混合物具有允許所述細胞外核酸結合于所述固相的所述陰離子交換基團的第一pH；其中所述樣品占所述結合混合物體積的至少85％；

b.分離帶有所述被結合的細胞外核酸的所述固相；

c.任選地清洗所述細胞外核酸；

d.任選地從所述固相洗脫細胞外核酸。

2.權利要求1的方法，其包含下列步驟：

a.酸化所述樣品以建立結合條件，并在結合混合物中將所述細胞外核酸結合于所述固相，所述結合混合物具有允許所述細胞外核酸結合于所述固相的所述陰離子交換基團的≤6.5的第一pH，其中所述樣品占所述結合混合物體積的至少85％，并且其中所述固相由磁性粒子提供；

b.分離帶有所述被結合的細胞外核酸的所述固相；

c.任選地清洗所述細胞外核酸；

d.從所述固相洗脫細胞外核酸。

3.權利要求1或2的方法，其包含下列步驟：

a.酸化所述樣品以建立所述結合條件，并在結合混合物中將所述細胞外核酸結合于所述固相，所述結合混合物具有允許所述細胞外核酸結合于所述固相的所述陰離子交換基團的≤6.5的第一pH，其中所述樣品占所述結合混合物體積的至少85％，并且其中所述固相由帶有叔氨基、優選為二烷基氨基、更優選為二乙基氨基丙基的磁性粒子提供；

b.分離帶有所述被結合的細胞外核酸的所述固相；

c.任選地清洗所述細胞外核酸；

d.從所述固相洗脫細胞外核酸，其中被洗脫的核酸的長度和保持結合于所述陰離子交換基質的核酸的長度通過調整洗脫條件來控制，其中長度為約1000nt或更長、優選地700nt或更長、更優選地500nt或更長的核酸在所述洗脫步驟中絕大多數保持結合于所述固相。

4.權利要求2或3的方法，其中在步驟d.中，通過調整所述固相表面上正電荷的濃度，使得在步驟d.期間只有較長的核酸分子保持結合于所述固相，而較小的核酸被洗脫，來實現短核酸的選擇性洗脫，其中截止值通過選擇在洗脫期間使用的pH值來控制。

5.權利要求2至4的一項或多項的方法，其中在步驟d.中，細胞外核酸按照它們的尺寸被選擇性洗脫，其中所述尺寸分級洗脫步驟包括在高于所述第一pH的第二pH下洗脫一部分結合于所述固相的細胞外核酸，其中在這一步驟中從所述固相洗脫的核酸的平均長度短于保持結合于所述固相的核酸的平均長度。

6.權利要求1至5的一項或多項的方法，其通過將細胞外核酸結合于帶有陰離子交換基團的固相，用于從貧細胞或無細胞樣品、優選為血漿或血清分離所述細胞外核酸，其中所述固相由優選地帶有叔胺、優選地包含二乙基氨基丙基的磁性粒子提供，所述方法包括下列步驟：

a.酸化所述樣品以建立所述結合條件，并在結合混合物中將所述細胞外核酸結合于所述固相，所述結合混合物具有允許所述細胞外核酸結合于所述固相的所述陰離子交換基團的≤6的第一pH，其中所述樣品占所述結合混合物體積的至少85％；

b.分離帶有所述被結合的細胞外核酸的所述固相；

c.任選地清洗所述細胞外核酸；

d.從所述固相洗脫細胞外核酸，其中在步驟d.中，細胞外核酸按照它們的尺寸被選擇性洗脫，其中所述尺寸分級洗脫步驟包括在高于所述第一pH并≥8的第二pH下洗脫一部分結合于所述固相的細胞外核酸，其中在這一步驟中從所述固相洗脫的核酸的平均長度短于保持結合于所述固相的核酸的平均長度，并且其中長度為約1000nt或更長、優選地700nt或更長、更優選地500nt或更長的核酸在所述洗脫步驟中絕大多數保持結合于所述固相。

7.權利要求2至6的一項或多項的方法，其中在步驟d)中，所述核酸按照它們的尺寸被選擇性洗脫，其中截止值由在所述洗脫期間使用的pH值和/或鹽濃度來控制。

8.權利要求1至7的一項或多項的方法，其中將所述樣品分拆，將所述樣品部分平行地進行處理，并將洗脫液或洗脫之前的陰離子交換材料重新合并。

9.權利要求1至8的一項或多項、尤其是權利要求1的方法，其中所述結合混合物通過將所述樣品的pH調整到所述第一pH來制備。