[發明專利]在絲狀真菌宿主細胞中產生多種重組多肽的方法

在審

• 申請號: 201280052277.8
• 申請日: 2012-08-23
• 公開（公告）號: CN103890180A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: D·亞韋;金綺明
• 申請（專利權）人: 諾維信股份有限公司
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 龍淳;顧小曼

1.一種構建用于產生具有生物活性的多種重組多肽的絲狀真菌菌株的方法，其包括：

(a)通過向絲狀真菌菌株中導入第一串聯構建體，通過靶向整合取代內源性第一基因，所述第一串聯構建體包含(i)所述第一基因的同源5’區、其同源側翼區或其組合，(ii)一個或多個第一可選擇性標記物，(iii)與第一啟動子和第一終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第一多肽的第一多核苷酸，(iv)與第二啟動子和第二終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第二多肽的第二多核苷酸，和(v)所述第一基因的同源3’區、其同源側翼區或其組合；

(b)通過向所述絲狀真菌菌株中導入第二串聯構建體，通過靶向整合取代內源性第二基因，所述第二串聯構建體包含(i)所述第二基因的同源5’區、其同源側翼區或其組合，(ii)一個或多個第二可選擇性標記物，(iii)與第三啟動子和第三終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第三多肽的第三多核苷酸，(iv)與第四啟動子和第四終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第四多肽的第四多核苷酸，和(v)所述第二基因的同源3’區、其同源側翼區或其組合；或

(c)(a)和(b)的組合。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述第一基因是編碼選自以下的纖維二糖水解酶I的纖維二糖水解酶I基因：(i)包含SEQ?ID?NO:2的成熟多肽的纖維二糖水解酶I，(ii)包含與SEQ?ID?NO:2的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的纖維二糖水解酶I，(iii)由包含與SEQ?ID?NO:1的成熟多肽編碼序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸所編碼的纖維二糖水解酶I，和(iv)由在至少高等嚴格條件例如非常高等嚴格條件下與SEQ?ID?NO:1的成熟多肽編碼序列或其全長互補體雜交的多核苷酸所編碼的纖維二糖水解酶I；

并且其中所述第二基因是編碼選自以下的纖維二糖水解酶II的纖維二糖水解酶II基因：(i)包含SEQ?ID?NO:4的成熟多肽的纖維二糖水解酶II，(ii)包含與SEQ?ID?NO:4的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的纖維二糖水解酶II，(iii)由包含與SEQ?ID?NO:3的成熟多肽編碼序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸所編碼的纖維二糖水解酶II，和(iv)由在至少高等嚴格條件例如非常高等嚴格條件下與SEQ?ID?NO:3的成熟多肽編碼序列或其全長互補體雜交的多核苷酸所編碼的纖維二糖水解酶II。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其中一個或多個串聯構建體還包含一個或多個可選擇性標記物的5’側翼的第一同源重復和所述一個或多個可選擇性標記物的3’側翼的第二同源重復，其中所述第一同源重復和所述第二同源重復進行同源重組，以切除所述一個或多個可選擇性標記物。