[發明專利]聚合酶組合物、制備和使用所述聚合酶組合物的方法

在審

• 申請號: 201280048344.9
• 申請日: 2012-08-10
• 公開（公告）號: CN103857805A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發明（設計）人: P·范德霍恩;T·尼基弗羅夫;羅國斌;M·蘭狄斯;D·馬祖爾;E·托澤;T·林斯庫姆
• 申請（專利權）人: 生命技術公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N9/12
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 李程達

1.一種用于進行核苷酸聚合反應的方法，包括：

在一個或多個核苷酸存在的情況下，在高離子強度溶液存在的情況下，將修飾的聚合酶或其生物活性片段與核酸模板接觸，其中所述修飾的聚合酶或其生物活性片段相對于參照聚合酶包括一個或多個氨基酸修飾并且相對于參照聚合酶具有增加的解離時間常數；和

使用修飾的聚合酶或其生物活性片段聚合所述一個或多個核苷酸的至少一個。

2.權利要求1的方法，其中所述聚合還包括以模板依賴性方式聚合至少一個核苷酸。

3.權利要求1的方法，還包括在接觸之前、期間或之后將引物與核酸模板雜交，并且其中所述聚合包括使用修飾的聚合酶或其生物活性片段將至少一個核苷酸聚合至引物的末端。

4.權利要求1的方法，其中在能夠檢測至少一個核苷酸被所述修飾的聚合酶或其生物活性片段聚合的傳感器附近進行所述聚合。

5.權利要求1的方法，還包括使用傳感器檢測表明一個或多個核苷酸的至少一個被所述修飾的聚合酶或其生物活性片段聚合的信號。

6.權利要求5的方法，其中所述傳感器是ISFET。

7.權利要求1的方法，其中所述高離子強度溶液含有約200mM至約300mM的鹽。

8.權利要求7的方法，其中所述鹽包括NaCl和/或KCl。

9.權利要求1的方法，其中所述修飾的聚合酶或其生物活性片段包含與SEQ?ID?NO:2、SEQ?ID?NO:3、SEQ?ID?NO:4、SEQ?ID?NO:19、SEQ?ID?NO:20或SEQ?ID?NO:24具有至少90%的同一性的至少100個氨基酸殘基。

10.一種用于進行核酸擴增的方法，包括：

產生具有修飾的聚合酶或其生物活性片段、引物、核酸模板以及一個或多個核苷酸的擴增反應混合物，其中所述修飾的聚合酶或其生物活性片段相對于參照聚合酶包括一個或多個氨基酸修飾并且相對于參照聚合酶具有增加的解離時間常數；和

將擴增反應混合物經歷擴增條件，其中使用所述修飾的聚合酶或其生物活性片段將所述一個或多個核苷酸的至少一個聚合至引物的末端，并且其中所述擴增條件包括高離子強度溶液的存在。

11.權利要求10的方法，其中所述高離子強度溶液包含約200mM至約300mM?NaCl或KCl。

12.權利要求10的方法，其中所述擴增條件包括通過聚合酶鏈式反應、乳液聚合酶鏈式反應、等溫擴增、重組聚合酶擴增或鏈置換擴增擴增核酸模板。

13.一種檢測核苷酸摻入的方法，包括：

在高離子強度溶液存在的情況下使用修飾的聚合酶或其生物活性片段、核酸模板和一個或多個核苷三磷酸進行核苷酸摻入；從而產生核苷酸摻入的一種或多種副產品；和

檢測核苷酸摻入的一種或多種副產品的至少一種的存在，從而檢測核苷酸摻入。

14.權利要求13的方法，其中所述檢測包括測定核苷酸摻入的身份。

15.權利要求13的方法，其中核苷酸摻入的副產品是氫離子。

16.權利要求15的方法，其中所述離子是氫離子。

17.一種用于進行核酸測序的方法，包括：

在一個或多個核苷酸存在的情況下，在高離子強度溶液存在的情況下，將修飾的聚合酶或其生物活性片段與核酸模板接觸，其中所述修飾的聚合酶或其生物活性片段相對于參照聚合酶包括一個或多個氨基酸修飾，并且其中所述修飾的聚合酶或其生物活性片段相對于參照聚合酶具有增加的解離時間常數；和

使用所述修飾的聚合酶或其生物活性片段聚合一個或多個核苷酸的至少一個。

18.權利要求17的方法，其中所述一個或多個核苷酸不包含可檢測標記物。

19.權利要求17的方法，其中所述修飾的聚合酶具有與SEQ?ID?NO:2、SEQ?ID?NO:3、SEQ?ID?NO:4、SEQ?ID?NO:15、SEQ?ID?NO:18、SEQ?ID?NO:19、SEQ?ID?NO:20或SEQ?ID?NO.24的至少95%的同一性。

20.權利要求17的方法，其中所述方法還包括測定被修飾的聚合酶聚合的一個或多個核苷酸的身份。