[發明專利]純化天然或突變體形式的白喉毒素的方法

無效

• 申請號: 201280039610.1
• 申請日: 2012-06-08
• 公開（公告）號: CN103732610A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: A.R.格爾克;T.斯瓦布;P.麥休;K.瓦倫特
• 申請（專利權）人: 默沙東公司
• 主分類號: C07H21/04
• 分類號: C07H21/04
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李波;萬雪松

1.從包含白喉毒素或其突變體形式的混合物中純化白喉毒素或其突變體形式的方法，所述方法包括：

a）在白喉毒素或其突變體形式結合第一分離劑的條件下，使混合物與第一分離劑接觸；

b）從所述第一分離劑洗脫白喉毒素或其突變體形式；

c）在白喉毒素或其突變體結合第二分離劑的條件下，使從步驟a）獲得的洗脫材料與第二分離劑接觸；

d）從所述第二分離劑洗脫所述白喉毒素或其突變體形式；

其中，1）所述第一分離劑是羥基磷灰石并且所述第二分離劑是多模式樹脂；或2）所述第一分離劑是多模式樹脂并且所述第二分離劑是羥基磷灰石；并且當所述第一分離劑或第二分離劑是羥基磷灰石時，在從羥基磷灰石洗脫之前，所述羥基磷灰石在使得雜質被去除的條件下進行清洗步驟。

2.權利要求1的方法，其中所述清洗使用包括0.01-1.0M氯化鉀或氯化鈉，在pH6.5-8.0的清洗溶液。

3.權利要求2的方法，其中所述清洗緩沖液進一步包括0.1-20mM磷酸鉀或磷酸鈉。

4.權利要求1的方法，其中所述從羥基磷灰石的洗脫包括

a）使用包括≥約30mM氯化鉀或氯化鈉或約≥15mM磷酸鉀或磷酸鈉的洗脫緩沖液的分步洗脫；

b）包括從約10至約25mM磷酸鉀或磷酸鈉或從約100mM至2M氯化鉀或氯化鈉的梯度洗脫；或

c）≥0.3pH單位的pH變化。

5.權利要求1的方法，其中與多模式樹脂接觸的混合物或洗脫的材料包括Tris、MES、MOPS、HEPES、磷酸鹽、醋酸鹽、氯化物或硫酸鹽。

6.權利要求1的方法，其中所述從多模式樹脂的洗脫包括

a）使用包括≥約125mM氯化鉀或氯化鈉，在pH6.8-9.5的洗脫緩沖液的分步洗脫；

b）包括從約0.2至約0.3M?氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸銨、硫酸鋰、氯化鋰或氯化銨的梯度洗脫；

c）在6.5-9.5的pH范圍內≥0.5pH單位的pH變化；或

d）在2-30℃的溫度內≥?1℃的溫度變化。

7.權利要求5的方法，其中與多模式樹脂接觸的混合物或洗脫的材料包括EDTA或蛋白酶抑制劑。

8.權利要求6的方法，其中所述洗脫在EDTA或蛋白酶抑制劑的存在下發生。

9.權利要求1的方法，其中所述第一分離劑是羥基磷灰石并且所述第二分離劑是多模式樹脂。

10.權利要求1的方法，其中所述多模式樹脂包含包括帶電部分和疏水部分的配體。

11.權利要求10的方法，其中所述帶電部分是帶負電的部分。

12.權利要求11的方法，其中所述帶負電的部分是陰離子羧酸基團或陰離子磺酸基團，用于陽離子交換。

13.權利要求12的方法，其中所述多模式樹脂是Capto-MMC?。

14.權利要求10的方法，其中所述帶電部分是帶正電的部分。

15.權利要求14的方法，其中所述多模式樹脂是Capto-Adhere?。

16.權利要求1的方法，其中在進行步驟（a）之前，所述混合物進行下列的一項或多項：離心、絮凝、澄清或陰離子交換層析。

17.權利要求16的方法，其中所述混合物在陰離子交換層析上進行兩次或三次經過。

18.權利要求16的方法，其中所述混合物進行離心、絮凝、澄清和陰離子交換層析。

19.權利要求18的方法，其中所述澄清是經離心和深層過濾。

20.權利要求1的方法，其中所述混合物從培養的宿主細胞獲得。

21.權利要求20的方法，其中所述培養的宿主細胞是滲透壓休克的。

22.權利要求20的方法，其中所述發酵細胞通過離心或微濾回收。

23.權利要求1的方法，其中所述混合物從無細胞生產系統獲得。