[發明專利]用于柄銹菌亞門和黑粉菌亞門的基因操作和表達系統

有效

• 申請號: 201280038496.0
• 申請日: 2012-05-10
• 公開（公告）號: CN104245938B
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發明（設計）人: L·H·紀;Y·B·劉;C·M·J·許;L·H·孫
• 申請（專利權）人: 淡馬錫生命科學研究院有限公司
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/64;C12N15/65;C12N15/113
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 左路;林曉紅

1.一種多核苷酸構建體，其包含可操作地連接可選擇標記的編碼序列的啟動子，所述可選擇標記的編碼序列可操作地連接至轉錄終止子，其中所述可選擇標記的編碼序列由SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列組成，其中所述啟動子衍生自選自下述的真菌物種：黑粉菌(Ustilago)屬的物種、曲霉菌(Aspergillus)屬的物種、紅冬孢酵母(Rhodosporidium)屬的物種；擲孢酵母(Sporobolomyces)屬中的物種；紅酵母(Rhodotorula)屬中的物種，并且其中所述多核苷酸構建體提供圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)的經轉化的真菌細胞的有效和顯性的選擇。

2.權利要求1的構建體，其中所述啟動子衍生自編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶gpd的基因或編碼蛋白質翻譯延伸因子tef的基因。

3.權利要求1的構建體，其中所述啟動子選自由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列組成的啟動子、由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列組成的啟動子、由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列組成的啟動子、由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列組成的啟動子、由SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列組成的啟動子、由SEQ ID NO:51所示的核苷酸序列組成的啟動子、由SEQ IDNO:55所示的核苷酸序列組成的啟動子、和由SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列組成的啟動子。

4.一種用于轉化柄銹菌(Pucciniomycotina)亞門和黑粉菌(Ustilaginomycotina)亞門的物種的真菌細胞的方法，其包括：

(a)用權利要求1的構建體轉化真菌細胞，和

(b)選擇經轉化的真菌菌落。

5.權利要求4的方法，其中所述真菌細胞是紅冬孢酵母屬、孢堆黑粉菌屬(Sporisorium)、黑粉菌屬、紅酵母屬、Pseudozyma或擲孢酵母屬的物種。

6.權利要求4的方法，其中所述啟動子衍生自編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶gpd的基因或編碼蛋白質翻譯延伸因子tef的基因。

7.權利要求4的方法，其中所述啟動子選自由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列組成的啟動子、由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列組成的啟動子、由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列組成的啟動子、由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列組成的啟動子、由SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列組成的啟動子、由SEQ ID NO:51所示的核苷酸序列組成的啟動子、由SEQ ID NO:55所示的核苷酸序列組成的啟動子、和由SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列組成的啟動子。

8.權利要求4-7中任一項的方法，其中所述轉化包括使所述真菌細胞與根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)一起共培養的步驟，所述根瘤土壤桿菌含有包含所述構建體的載體，并且所述共培養在固體共培養培養基上進行或在置于固體培養基之上的共培養膜上進行。

9.權利要求8的方法，其中所述選擇通過將固體選擇培養基覆蓋到所述固體共培養培養基之上進行或通過將所述共培養膜轉移至固體選擇培養基來進行。

10.權利要求8的方法，其中所述共培養培養基含有至少1.5％瓊脂。

11.權利要求10的方法，其中所述共培養培養基含有2％-3％瓊脂。

12.權利要求9的方法，其中所述共培養培養基和所述選擇培養基含有至少1.5％瓊脂。

13.權利要求11的方法，其中所述共培養培養基和所述選擇培養基含有2％-3％瓊脂。

14.一種用于減少靶向基因組中的假轉化體的方法，其包括步驟：

(a)用權利要求1-3中任一項的構建體轉化所述靶向基因組的細胞；和

(b)在選擇劑的最大濃度下選擇經轉化的細胞。