[發明專利]鞘磷脂的測定方法和測定用試劑盒

在審

• 申請號: 201280037421.0
• 申請日: 2012-07-25
• 公開（公告）號: CN103717748A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 木村豪秀;宮內一人;桑田英之
• 申請（專利權）人: 協和梅迪克斯株式會社
• 主分類號: C12Q1/44
• 分類號: C12Q1/44;C12Q1/26;C12Q1/28;C12Q1/30;C12Q1/32
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 金龍河;穆德駿

技術領域

本發明涉及鞘磷脂的測定方法和測定用試劑盒。

背景技術

在血液中含有高密度脂蛋白(以下簡記為HDL)、低密度脂蛋白(以下簡記為LDL)、極低密度脂蛋白(以下簡記為VLDL)、乳糜微粒(以下簡記為CM)等脂蛋白。各脂蛋白的膽固醇、甘油三酯、磷脂、蛋白質等構成成分的比例不同，在生物體內具有不同的作用。在脂蛋白中主要含有三種磷脂，即，磷脂酰膽堿(以下簡記為PC)、溶血磷脂酰膽堿(以下簡記為LPC)、鞘磷脂(以下簡記為SM)。

在這三種磷脂中，PC和SM為主要的磷脂，分別占全部磷脂的約7成和約2成。已知SM蓄積在人和動物模型的粥樣斑塊(Atheroma)中。存在于人的動脈硬化斑塊中的LDL，與血漿中的LDL相比，含有更多的SM(非專利文獻1)。

另一方面，在人的臨床研究中也顯示出血漿中的SM和SM/PC比率是相對于缺血性心臟病而言獨立的危險因素(非專利文獻2～4)。

至今，作為SM的測定方法，報道了使用薄層色譜的方法和使用高效液相色譜的方法(非專利文獻5)，但具有操作煩雜且測定需要長時間等缺點。另外，也報道了利用來源于細菌的鞘磷脂酶的酶測定法(專利文獻1、非專利文獻2)。本測定法為如下方法：將鞘磷脂通過細菌的鞘磷脂酶水解成磷酸膽堿和N-酰基鞘氨醇，將生成的磷酸膽堿通過堿性磷酸酶水解成膽堿，使生成的膽堿與膽堿氧化酶反應，測定生成的過氧化氫，由此，測定鞘磷脂。但是，本測定法具有因使用堿性磷酸酶而產生的對其他測定項目的測定的影響、鞘磷脂酶與SM一起同LPC反應的特異性等問題(非專利文獻6)。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：日本特表2009-519713號公報

非專利文獻

非專利文獻1：Circulation,Vol.110(22),p.3465-3471(2004).

非專利文獻2：Arterioscler?Thromb?Vasc?Biol.,Vol.20,p.2614-2618(2000).

非專利文獻3：Nutrition&Metabolism,Vol.3,p.5(2006).

非專利文獻4：Am.J.Epidemiol.,Vol.163,p.903-912(2006).

非專利文獻5：Dairy?Sci.,Vol.88,p.482-488(2005).

非專利文獻6：Biol.Pharm.Bull.Vol.27,p.1725-1729(2004).

發明內容

發明要解決的問題

本發明的目的在于，提供用于簡便并且準確地測定樣本中的SM的方法和試劑盒。

用于解決問題的方法

本發明人為了解決上述問題而進行了深入的研究，發現，在選擇性地測定含有PC、LPC和SM的樣本中的SM的方法中，通過使用不與使LPC與溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶反應而生成的甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應但與SM反應的磷脂酶D，能夠特異性地測定SM，從而完成了本發明。即，本發明涉及以下的[1]～[17]。

[1]一種樣本中的SM的測定方法，其特征在于，使樣本與不與SM和LPC反應而與PC反應的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、以及膽堿氧化酶反應，并消去生成的過氧化氫，接著，使樣本與不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應而與SM反應的磷脂酶D、以及膽堿氧化酶反應，并測定生成的過氧化氫。

[2]一種樣本中的SM的測定方法，其特征在于，使樣本與不與SM和LPC反應而與PC反應的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、氧化型輔酶、膽堿脫氫酶以及還原型輔酶氧化酶反應，并消去生成的過氧化氫，接著，使樣本與不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應而與SM反應的磷脂酶D、氧化型輔酶、膽堿脫氫酶以及還原型輔酶氧化酶反應，并測定生成的過氧化氫。

[3]如[1]所述的方法，其中，在過氧化氫酶存在下進行樣本與不與SM和LPC反應而與PC反應的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、以及膽堿氧化酶的反應，在過氧化氫酶抑制劑存在下進行樣本與不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應而與SM反應的磷脂酶D、以及膽堿氧化酶的反應。