[發(fā)明專利]重組蛋白通過與PNGaseF共表達(dá)在活體內(nèi)去糖基化

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201280037381.X
• 申請(qǐng)日: 2012-06-07
• 公開（公告）號(hào): CN103906840B
• 公開（公告）日: 2018-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 塔爾蘭·馬梅多夫;維達(dá)季·尤西波夫
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 艾比歐公司
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N9/80
• 代理公司: 北京律盟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司11287
• 代理人: 王允方

技術(shù)領(lǐng)域

此文件涉及用于在植物中以非糖基化形式產(chǎn)生重組蛋白的材料和方法。

背景技術(shù)

已經(jīng)研究基于植物的表達(dá)作為一種產(chǎn)生重組醫(yī)藥蛋白的方法。此技術(shù)尤其可用于表達(dá)糖基化蛋白。舉例來說，哺乳動(dòng)物糖蛋白當(dāng)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)時(shí)有效糖基化。

然而，植物糖基化蛋白質(zhì)的能力對(duì)基于植物的表達(dá)系統(tǒng)的有效性也存在重要限制。舉例來說，一些真核生物(例如，瘧原蟲屬(Plasmodium)寄生蟲)缺少用于N-連接糖基化的機(jī)制。源自這些物種的蛋白質(zhì)可含有多個(gè)當(dāng)在植物中表達(dá)時(shí)可異常糖基化的潛在糖基化位點(diǎn)，此由于(例如)表位的不正確/改變的折疊或遮蔽而導(dǎo)致降低的功能性和免疫原性。實(shí)際上，碳水化合物的附著可強(qiáng)烈影響蛋白質(zhì)的物理-化學(xué)性質(zhì)，且因此可改變必需的生物學(xué)功能，例如蛋白質(zhì)的免疫原性、特定活性和配體-受體相互作用。

異常N-糖基化對(duì)于許多治療應(yīng)用產(chǎn)生許多問題。舉例來說，癌細(xì)胞經(jīng)常以蛋白質(zhì)N-糖基化異常增加為特征(米哈依(Mihai)等人，(2009)癌癥研究(Cancer Res.)69：5673)。另外，細(xì)胞表面受體(包括整合素和鈣粘素)的異常N-糖基化似乎與癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的變化相關(guān)聯(lián)(果(Guo)等人，(2002)癌癥研究62：6837-6845；帕特里奇(Partridge)等人，(2004)科學(xué)(Science)306：120-124；和伊佐治(Isaii)等人(2004)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)279：19747-19754)。而且，植物與哺乳動(dòng)物的N-連接聚糖之間存在重要結(jié)構(gòu)差異。舉例來說，植物復(fù)合N-聚糖含有人類復(fù)合聚糖中不存在的β1，2-木糖和α1，3-巖藻糖殘基。另外，應(yīng)注意，由于不同的糖基化階段，當(dāng)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)時(shí)可產(chǎn)生多種形式的重組蛋白，由此在蛋白質(zhì)純化期間分離這些形式產(chǎn)生額外的工作。

已經(jīng)努力人源化在植物中表達(dá)的生物醫(yī)藥的N-連接糖基化和N-聚糖(巴克(Bakker)等人(見上文)；圣-捷雷-杜帕斯(Saint-Jore-Dupas)等人，(2007)生物技術(shù)趨勢(shì)(Trends Biotechnol.)25(7)：317-323；弗雷(Frey)等人，(2009)植物生物技術(shù)雜志(Plant Biotechnol.J.)7(1)：33-48；松尾(Matsuo)和松村(Matsumura)(2011)植物生物技術(shù)雜志9(2)：264-281；伊東美咲(Misaki)等人，(2003)糖生物學(xué)(Glycobiol.)13(3)；199-205；帕勞克帕(Palacpac)等人，(1999)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)96(8)：4692-4697；斯特拉瑟(Strasser)等人，(2009)生物化學(xué)雜志284(31)：20479-20485；和維齊納(Vézina)等人，(2009)植物生物技術(shù)雜志7(5)：442-455)。

然而，之前尚未在任何真核系統(tǒng)(包括在植物系統(tǒng))中滿意地實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)在活體內(nèi)的酶去糖基化。舉例來說，例如使用衣霉素(tunicamycin)阻斷N-糖基化的策略在植物中導(dǎo)致蛋白質(zhì)的不均勻表達(dá)(霍里(Hori)和艾爾賓(Elbein)(1981)植物生理學(xué)(Plant Physiol.)67：882-886；和弗蘭克(Frank)等人，(2008)植物生理學(xué)148(3)：1354-1367)。

發(fā)明內(nèi)容

此文件提供使用瞬時(shí)表達(dá)方法在植物細(xì)胞中產(chǎn)生去糖基化形式的蛋白質(zhì)(例如，特別的候選疫苗或治療性蛋白質(zhì))的材料和方法。使用這些方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)對(duì)于其功能性和免疫原性來說可尤其有用。

此文件部分地基于研發(fā)在細(xì)胞中通過瞬時(shí)表達(dá)細(xì)菌性肽：N-糖苷酶F(PNGase F)與所關(guān)注的另一種多肽的組合在植物細(xì)胞中產(chǎn)生去糖基化蛋白的方法。之前還未在植物系統(tǒng)中表達(dá)細(xì)菌性PNGase F。如下文實(shí)例中所闡述，細(xì)菌性PNGase F是與多種重組蛋白(特別地，瘧疾(malaria)候選疫苗Pfs48F1E、炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)保護(hù)性抗原(PA)和對(duì)抗炭疽芽孢桿菌PA的抗體)在本塞姆氏煙草(Nbenthamiana)中瞬時(shí)共表達(dá)。細(xì)菌性PNGase F在活體內(nèi)具有完全活性且成功地從靶標(biāo)糖蛋白裂解N-連接的寡糖，獲得所表達(dá)蛋白質(zhì)的均勻性。