[發(fā)明專利]對應(yīng)于轉(zhuǎn)基因事件KK179-2的苜蓿植物和種子及其檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201280032382.5
• 申請日: 2012-06-28
• 公開（公告）號: CN103857798B
• 公開（公告）日: 2018-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: C·利弗林;D·惠倫;S·坦普爾;M·麥卡斯林;M·S·雷迪;W·希亞特;W·伯恩斯;R·E·塞爾尼
• 申請（專利權(quán)）人: 孟山都技術(shù)公司;福拉格遺傳國際有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/12;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京市金杜律師事務(wù)所 11256
• 代理人: 陳文平

本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因苜蓿事件KK179?2。本發(fā)明還提供了與所述事件相關(guān)的細(xì)胞、植物部分、種子、植物、商品以及對于所述事件是獨特的并且通過將轉(zhuǎn)基因DNA插入苜蓿植物的基因組來產(chǎn)生的DNA分子。本發(fā)明進一步提供了用于檢測所述苜蓿事件核苷酸序列在樣本中的存在的方法，用于檢測診斷所述苜蓿事件的存在的核苷酸序列的探針和引物。

相關(guān)申請的交叉引用

本申請根據(jù)35U.S.C.§119(e)有權(quán)要求于2011年6月30日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/503,373和2012年6月26日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/664,359的優(yōu)先權(quán)，所述美國臨時專利申請的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。

序列表的并入

稱為“57978_seq_listing.txt”的序列表為10,564字節(jié)(在MS-WINDOWS中測量)，以電子形式提交，創(chuàng)建于2012年5月1日，并且通過引用并入本文。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及苜蓿轉(zhuǎn)基因事件KK179-2。本發(fā)明還提供了與所述事件相關(guān)的細(xì)胞、植物部分、種子、植物、商品，以及對于事件是獨特的并且通過將轉(zhuǎn)基因DNA插入苜蓿植物的基因組來產(chǎn)生的DNA分子。本發(fā)明進一步提供了用于檢測所述苜蓿事件核苷酸序列在樣本中的存在的方法，用于檢測診斷所述苜蓿事件的存在的核苷酸序列的探針和引物。

發(fā)明背景

苜蓿(Medicago sativa)是世界上栽培最多的豆類作物，其中美國是頭號苜蓿生產(chǎn)國。生物技術(shù)的方法已應(yīng)用于苜蓿以改善產(chǎn)品的農(nóng)藝性狀和質(zhì)量。一種這樣的農(nóng)藝性狀是增加的木質(zhì)素含量。

木質(zhì)素是第二豐富的陸地生物聚合物且占有機碳的30％。木質(zhì)素對于細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)完整性是至關(guān)重要的并且其賦予莖硬度和強度。木質(zhì)素含量與奶牛的飼料消化率逆相關(guān)。可通過表達能夠提供木質(zhì)素的減少并且同時提供增加的苜蓿消化率的RNA抑制構(gòu)建體來在轉(zhuǎn)基因植物中獲得此類減少。已知外源基因或抑制分子在植物中的表達受很多因素影響，這些因素例如使用的調(diào)控元件、轉(zhuǎn)基因插入物的染色體定位、靠近轉(zhuǎn)基因插入位點的任何內(nèi)源調(diào)控元件的接近度(proximity)、以及環(huán)境因素例如光和溫度。例如，已觀察到在類似產(chǎn)生的事件之間在轉(zhuǎn)基因抑制的總體水平上或轉(zhuǎn)基因抑制的空間或時間模式上存在變化。為此原因，通常必需篩選數(shù)百個獨立轉(zhuǎn)化事件以最終鑒定對于商業(yè)農(nóng)業(yè)目的有用的一個事件。一旦被鑒定為具有期望的抑制表型、分子特征和改善的性狀，那么可使用植物育種方法將這樣的事件用于將該改善的性狀滲入其他遺傳背景。所得的后代可含有轉(zhuǎn)基因事件，并且因此可具有原始轉(zhuǎn)化體的該性狀的相同特征。這可用于產(chǎn)生許多不同的包含改良的性狀并且經(jīng)適當(dāng)?shù)馗脑爝m合于特定地方生長條件的作物品種。

能夠檢測特定植物的轉(zhuǎn)基因/基因組DNA的存在以便確定有性雜交的后代是否含有所關(guān)注的轉(zhuǎn)基因/基因組DNA將是有利的。此外，用于檢測特定植物的方法當(dāng)遵守需要上市前批準(zhǔn)和標(biāo)記來源于轉(zhuǎn)基因作物植物的食品的規(guī)程時將是有用的。

抑制元素的存在或不存在可通過任何公知的核酸檢測方法例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或使用核酸探針的DNA雜交來檢測。這些檢測方法一般集中于常用的遺傳元件例如啟動子、終止子、標(biāo)記基因等。這樣，此類方法可能不用于區(qū)分不同轉(zhuǎn)化事件，特別是使用相同DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的那些，除非鄰近插入DNA(“側(cè)翼DNA”)的染色體DNA的序列是已知的。事件特異性PCR測定例如由Tavemiers等(J.Agric.Food Chem.，53：3041-3052，2005)進行了討論，其中顯示了轉(zhuǎn)基因玉米品系Bt11、Bt176和GA21以及油菜(canola)事件GT73的事件特異性跟蹤系統(tǒng)。在該研究中，基于每個事件的基因組/轉(zhuǎn)基因接合處的序列設(shè)計事件特異性引物和探針。轉(zhuǎn)基因植物事件特異性DNA檢測方法也在美國專利號7,632,985；7,566,817；7,368,241；7,306,909；7,718,373；7,189,514、7,807,357和7,820,392中描述。

發(fā)明概述