[發明專利]編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶的GAP基因的啟動子的變體

有效

• 申請號: 201280031927.0
• 申請日: 2012-06-22
• 公開（公告）號: CN103635578A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: A·雷特;B·巴特;S·漢斯;W·克萊斯
• 申請（專利權）人: 贏創德固賽有限公司
• 主分類號: C12N15/77
• 分類號: C12N15/77;C12P13/06;C12P13/08;C12P13/10;C12R1/15;C12N9/00
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 于輝

本發明涉及使用遺傳修飾的微生物來制備精細化學品的方法，在所述微生物中編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶的gap基因的啟動子的變體使各種基因能夠過表達。

現有技術

精細化學品(特別是指氨基酸、有機酸、維生素、核苷和核苷酸)被用于人類醫學，用于藥物、化妝和食品工業以及用于動物營養。

許多這些化合物是通過發酵棒狀桿菌的菌株來制備的，特別是谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium?glutamicum)。由于非常重要，一直有努力在改善其生產方法。所述方法可以針對發酵相關的手段來進行改善，如例如，攪拌和氧氣供應，或者針對營養培養基的組成如例如發酵期間的糖濃度，或者針對產物形式的建立例如通過離子交換層析的手段，或者針對微生物本身的內在性能特征。

通過利用誘變、突變體的選擇和挑選的方法來改善這些微生物的性能特征。以此方式獲得了對于抗代謝物具抗性并產生化合物的菌株，所述抗代謝物如例如賴氨酸類似物S-(2-氨乙基)-半胱氨酸或者纈氨酸類似物2-噻唑丙氨酸，所述化合物例如L-氨基酸如L-賴氨或L-纈氨酸。

多年來，重組DNA技術的方法已同樣被用于改善產L-氨基酸的谷氨酸棒狀桿菌菌株，其中通過例如增強或減弱個體氨基酸生物合成基因，以及研究對所述化合物生產的作用。

關于谷氨酸棒狀桿菌的生物學、遺傳學和生物技術的總結可以參見“Handbook?of?Corynebacterium?glutamicum”(Eds.:L.Eggeling和M.Bott，CRC?Press，Taylor&Francis，2005)，Journal?of?Biotechnology的特刊中(主編:A.Pühler)題目為A?New?Era?in?Corynebacterium?glutamicum?Biotechnology(Journal?of?Biotechnology104/1-3，(2003))，以及T.Scheper(總編輯)的書Microbial?Production?of?L-amino?acids(Advances?in?Biochemical?Engineering/Biotechnology79，Springer?Verlag，Berlin，Germany，2003)中。

谷氨酸棒狀桿菌基因組的核苷酸序列在Ikeda和Nakagawa的(Applied?Microbiology?and?Biotechnology62，99-109(2003))中，以及在EP1108790和Kalinowski等人(Journal?of?Biotechnology104/1-3，(2003))中有描述。

谷氨酸棒狀桿菌基因組的核苷酸序列從National?Library?of?Medicine?(Bethesda，MD，USA)的National?Center?for?Biotechnology?Information(NCBI)中的數據庫、從DNA?Data?Bank?of?Japan(DDBJ，Mishima，Japan)、或者從European?Molecular?Biologies?Laboratories(EMBL，Heidelberg，Germany，和Cambridge，UK)的核苷酸序列數據庫獲得。

Patek?et?al(Journal?of?Biotechnology104，311-323(2003))已描述和分析了谷氨酸棒狀桿菌編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶的gap基因的天然啟動子。

在US2008/0050786中，SEQ?ID?NO:20示出了稱作seqP-RBS_20的484bp的DNA分子，其含有包括了核糖體結合位點的gap基因的啟動子。此啟動子可有利地用于表達各種基因，如例如編碼天冬氨酸激酶的lysC基因,。為清楚起見，該序列被列為SEQ?ID?NO:1。

發明目標

本發明的目標是提供編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶的gap基因的啟動子和/或表達單元的變體，在所述變體的控制下，各種基因，如例如編碼天冬氨酸激酶的lysC基因可有利地表達。

發明描述

在進行本發明期間，發現SEQ?ID?NO:2所示的谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032gap基因啟動子的活性，在用核堿基腺嘌呤置換所述啟動子位置362處的核堿基鳥嘌呤之后得到了提高。