[發明專利]通過探測寡核苷酸切割及雜交的靶核酸序列的檢測

有效

• 申請號: 201280029060.5
• 申請日: 2012-05-03
• 公開（公告）號: CN103620056A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 千鐘潤;李榮祚
• 申請（專利權）人: SEEGENE株式會社
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/10;C12N15/11
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 林遠成

1.一種在固相基質上通過POCH（PO切割及雜交）試驗，從DN?A或核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：

步驟（a），將上述靶核酸序列與上游寡核苷酸及探測寡核苷酸（P?O）進行雜交；上述上游寡核苷酸包含與上述靶核酸序列互補的雜交核苷酸序列；上述PO包含含有與上述靶核酸序列互補的雜交核苷酸序列的靶向部位；上述PO具有單一標記；上述上游寡核苷酸位于上述PO的上游；上述上游寡核苷酸或其延伸鏈誘導基于具有5’核酸酶活性的酶的上述PO的切割；

步驟（b），在用于切割上述PO的條件下，將具有5’核酸酶活性的上述酶與上述步驟（a）的結果物相接觸；在上述PO與上述靶核酸序列雜交的情況下，上述PO被具有5’核酸酶活性的上述酶切割而生成包含單一標記的片段；

步驟（c），將在上述固相基質上實現固定化的俘獲寡核苷酸（C?O）與上述步驟（b）的結果物相接觸而實施雜交反應；上述CO包含與上述PO雜交的核苷酸序列；上述包含單一標記的片段不與上述CO雜交，非切割PO與上述CO雜交而在形成非切割PO/CO二聚物的條件下，實施上述雜交反應；以及

步驟（d），測定來自上述固相基質上的上述單一標記的信號，來檢測上述PO是否發生切割；上述PO發生切割表示上述靶核酸序列存在。

2.根據權利要求1所述的在固相基質上通過POCH（探測寡核苷酸切割及雜交）試驗，從DNA或核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述CO中的與上述PO雜交的上述核苷酸序列包含與上述PO的靶向部位雜交的核苷酸序列。

3.根據權利要求1所述的在固相基質上通過POCH（探測寡核苷酸切割及雜交）試驗，從DNA或核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述PO為在其3’-部位還包含具有與上述靶核酸序列非-互補的核苷酸序列的標記部位的3’-標記PO，或者為在其5’-部位還包含具有與上述靶核酸序列非-互補的核苷酸序列的標記部位的5’-標記PO，上述CO中的與上述PO雜交的上述核苷酸序列包含與上述P?O的標記部位雜交的核苷酸序列。

4.根據權利要求3所述的在固相基質上通過POCH（探測寡核苷酸切割及雜交）試驗，從DNA或核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述單一標記位于不殘留在通過PO的切割來放出的包含標記部位的片段上的位置。

5.根據權利要求3所述的在固相基質上通過POCH（探測寡核苷酸切割及雜交）試驗，從DNA或核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述單一標記位于上述3’-標記PO的5’-末端或從5’-末端隔開1-10核苷酸的位置，或者位于5’-標記PO的3’-末端或從3’-末端隔開1-10核苷酸的位置。

6.根據權利要求1所述的在固相基質上通過POCH（探測寡核苷酸切割及雜交）試驗，從DNA或核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述PO為在其3’-部位還包含具有與上述靶核酸序列非-互補的核苷酸序列的標記部位的3’-標記PO，或者為在其5’-部位還包含具有與上述靶核酸序列非-互補的核苷酸序列的標記部位的5’-標記PO，上述CO中的與上述PO雜交的上述核苷酸序列包含與上述P?O的標記部位的一部分及上述PO的靶向部位的一部分雜交的核苷酸序列。

7.根據權利要求1所述的在固相基質上通過POCH（探測寡核苷酸切割及雜交）試驗，從DNA或核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述CO通過其5’-末端或3’-末端，在固相基質上實現固定化。

8.根據權利要求3所述的在固相基質上通過POCH（探測寡核苷酸切割及雜交）試驗，從DNA或核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述PO為3’-標記PO，上述CO通過其5’-末端，在固相基質上實現固定化。

9.根據權利要求3所述的在固相基質上通過POCH（探測寡核苷酸切割及雜交）試驗，從DNA或核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述PO為5’-標記PO，上述CO通過其3’-末端，在固相基質上實現固定化。

10.根據權利要求1所述的在固相基質上通過POCH（探測寡核苷酸切割及雜交）試驗，從DNA或核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述單一標記為熒光單一標記。