[發明專利]生物體組織分析用探針及其使用方法

有效

• 申請號: 201280013612.3
• 申請日: 2012-03-15
• 公開（公告）號: CN103562719A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 山形洋平;后藤昌史;渡邊君子
• 申請（專利權）人: 國立大學法人東北大學;明治制果藥業株式會社
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;C12N5/071;C07K14/435;C12N9/02;C12N9/52;C12N15/09
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 鐘守期;蘇萌

技術領域

本發明涉及通過酶分離由生物體組織高收率地得到具有高的生物活性的細胞或細胞群的方法，以及用于該方法的探針。

背景技術

來自生物體組織的細胞和細胞簇的酶分離可用于包括移植該細胞或建立細胞系等各種目的，以及治療、診斷和檢查等廣泛的用途。然而，為了解離生物體組織、分離其中含有的細胞或細胞集合體，有必要使細胞或細胞集合體游離至期望的程度，從而與細胞組織部分分離。從生物體組織分離細胞和細胞簇時，細胞間基質被膠原酶等蛋白質分解酶的混合物分解。

生物體組織由細胞和細胞間基質構成。細胞間基質是固定細胞的物質，有結構物和非結構物。前者有膠原纖維、彈性纖維、細網纖維等纖維，后者為填充在纖維之間的成分，為稱作底物的非溶膠的凝膠狀物質，有糖蛋白和蛋白多糖。細胞間基質的代表是稱為膠原（collagen）的蛋白質，占生物體內總蛋白質重量的約1/3。膠原具有纖維結構，正式地稱為膠原纖維。

組織大致分為上皮組織、支持組織、肌肉組織和神經組織4個類別。上皮組織是覆蓋在身體表面的組織，細胞密度高，沒有穿插細胞間基質。支持組織起著支持身體、臟器和細胞等的作用，包括結締組織、軟骨組織、骨組織、血液、淋巴。肌肉組織是以收縮運動為目的融合分化的細胞，細胞間基質所占的比例極低。

肌肉組織由肌肉細胞、結締組織、血管和神經構成，但是主要的結構物是肌肉纖維。神經組織主要由神經內膜和神經束膜構成，任一種均含有較多的細胞間基質（膠原）。結締組織是支持組織的一種，由脂肪組織和纖維性結締組織（以膠原纖維和彈性纖維為構成成分）組成，大致分為疏水性結締組織和堅韌性結締組織。疏水性結締組織是膠原不規則排列的纖維性結締組織，分布于皮下組織、粘膜組織、神經、血管外膜、小葉間組織等。

根據生物物種、年齡、性別、組織、生活環境等，細胞間基質中膠原的含量情況不同。但是，在何種組織的何種狀態的基質中以何種程度含有何種膠原仍不是十分明確。膠原的特征在于，構成蛋白質肽鏈的氨基酸具有如“-甘氨酸-氨基酸X-氨基酸Y”這樣甘氨酸每3個殘基重復一次的一級結構。據報道，人類的膠原蛋白質有30種以上，但是體內存在最豐富的是纖維性的I型膠原，非纖維性的IV型膠原的含量也很大，涉及通過分子間二硫鍵相互連接而形成網狀結構（非專利文獻1）。據報道，IV型膠原存在于胰島和內分泌組織之間（非專利文獻2、3）。

認為特定類型的膠原是否存在于目標基質中，理論上可通過使用針對各種類型膠原的抗體進行免疫染色來確定。然而，膠原的種類較多，且廣泛地存在于多細胞動物中，因此難以制作抗體等成為瓶頸，其實現是困難的。

作為組織分解用的酶，來自溶組織梭菌的各種類型的粗膠原酶除了含有2種膠原酶之外，還含有各種蛋白酶（膠原分解活性和非特異性的蛋白質分解活性）和非蛋白酶成分（磷脂酶等）。通過這種粗膠原酶，各細胞和細胞群從生物體組織中酶法分離。

據報道，各細胞或細胞群從生物體組織上酶法分離的時候，對于所分離的細胞或細胞群的收率及其生物活性，2種膠原酶（ColG和ColH）起重要作用，其用量比例有較大的影響（非專利文獻4）。在從胰臟組織中分離胰島的情況中，也使用由溶組織梭菌（Clostridium?histolyticum）產生的2種膠原酶（非專利文獻5、專利文獻1和2）。本發明人現已確認，通過使2種膠原酶的用量比例最優化，可以分離大量的胰島。

據報道，膠原酶根據其種類而具有不同的膠原結合域（非專利文獻6）。到目前為止，制備了各種功能性蛋白質和膠原結合域的融合蛋白質用于靶向和藥物輸送系統（DDS）。例如，可以列舉在溶組織梭菌的膠原結合域中結合bFGF或EGF的膠原結合性細胞生長因子（非專利文獻7）、源自牛血管性血友病因子的膠原結合十肽和TGF-β的融合蛋白質（非專利文獻8和9）、在纖維連接蛋白的膠原結合域中結合功能性肽的緩釋性細胞生長因子供給體（專利文獻3）。如此，可制備與膠原結合域的融合蛋白質用于靶向和組織可視化目的，但不能用于生物體組織的分析和分離。

為了對特定的組織和細胞進行無損傷分離，必須使所述組織和細胞周圍存在的細胞間基質分解。然而，在進行必要的細胞表面分解的同時，無損傷地僅將細胞間基質通過酶進行分解是不容易的。特別是根據人類臟器的情況、年齡、性別、生活習慣、病史等，通過蛋白質分解酶獲得的分解性不同，因此不得不通過經驗確定酶的種類和酶反應時間而進行分離。