[實用新型]一種檢測人杯狀病毒的三重熒光定量RT-PCR試劑盒

有效

• 申請號: 201220675431.4
• 申請日: 2012-12-10
• 公開（公告）號: CN203382766U
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 陳瑜;李蘭娟;謝國良;崔大偉
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

本實用新型屬生物技術領域，涉及一種檢測熒光定量RT-PCR試劑盒，具體涉及一種一步法檢測人杯狀病毒的三重實時熒光定量RT-PCR試劑盒。?

背景技術

人杯狀病毒（Human?calicivirus,HuCVs）是引起兒童和成人非菌性急性腹瀉的主要病原之一，僅次于輪狀病毒。它傳染性強，在世界各地廣泛傳播，尤其是對嬰幼兒健康影響較大。最早發現的人杯狀病毒是由美國學者Kapikin于1972年采用免疫電鏡方法從俄亥俄州諾瓦克地區一所學校暴發的胃腸炎病人糞便標本中檢出，并以發現地將其命名為諾瓦克病毒。此后，人杯狀病毒在世界各地不斷被發現，根據病毒形態結構、抗原特性、宿主范圍和所致疾病的臨床癥狀，以及病毒基因組序列和和遺傳進化分析的結果進行病毒分類，2002年8月第八次ICTV確定人杯狀病毒包括兩個屬：諾如病毒屬(Norovirus，NV)和札如病毒屬(sapovirus，SV)。?

諾如病毒毒株間具有很大核苷酸序列多樣性，依據基因結構ORFl和ORF2之間的差異，諾如病毒分為5個基因組（GI-GV），其中GI(以nonvalk-1ike?virus為代表)和GII(以Snow?Mountain?virus為代表)是感染人類的兩個最常見的基因組。?

札如病毒即札幌病毒，為單股正鏈RNA病毒，其原型毒株最早為1977年日本學者Chiba等從札幌某托兒所一系列的腹瀉爆發研究中所證實。此類病毒所致疾病主要與人和動物的胃腸炎有關，不同年齡段人群都可感染，引起腹瀉，主要以嬰幼兒最為易感。札如病毒主要經糞-口途徑傳播，在有些地區，札如病毒逐漸成為僅次于諾如病毒引起病毒性腹瀉的主要病因。?

由于人杯狀病毒不能進行細胞和組織培養，其檢測方法的發展受到了很大限制。傳統的杯狀病毒檢測方法主要有電鏡、放射免疫試驗、酶免疫試驗等，但這些方法均不夠敏感。隨著基因組測序技術的進展，據此建立的逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測人杯狀病毒，?使得檢測靈敏度大大提高。目前的方法學檢測中，RT-PCR方法已成為檢測人杯狀病毒最敏感、也是應用最廣泛的方法。?

實時熒光定量PCR技術具有全封閉單管擴增、簡便快捷、重復性好、實時定量、污染少等優勢，克服了以往臨床診斷的缺陷，具有高度的特異性和敏感性，為臨床診斷提供了準確可靠的實驗室依據，可作為一種臨床病原診斷的有效、快速的檢測手段。但是單管實時熒光定量RT-PCR檢測一種病原，不僅耗時耗力，也浪費試劑耗材，因而建立可同時檢測多種病原的多重實時熒光定量RT-PCR診斷方法與診斷試劑尤其重要。?

發明內容

本實用新型的目的是提供一種檢測人杯狀病毒的三重熒光定量RT-PCR試劑盒，由定量RT-PCR反應液管、酶混合液管、引物探針混合液管、陰性對照品管、三個標準品管、三個陽性對照品管和盒體組成。其中定量RT-PCR反應液管包含有PCR反應緩沖液、氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物，酶混合液管包含耐熱Taq?DNA聚合酶、RNA酶抑制劑和MMLV逆轉錄酶，引物探針混合液管包含三種病毒的特異性引物和相應的三種不同熒光標記的探針。三個標準品管分別放置GI型諾如病毒標準品、GII型諾如病毒標準品、札如病毒標準品；三個陽性對照品管分別放置GI型諾如病毒陽性對照品、GII型諾如病毒陽性對照品、札如病毒陽性對照品；陰性對照管包含高溫高壓滅菌的焦碳酸二乙酯處理水，三個陽性對照品管分別為包含GI型諾如病毒、GII型諾如病毒和札如病毒的保守區基因序列的陽性質粒樣品。引物探針混合液管需為棕色管。?

陰性對照為高溫高壓滅菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)處理水，陽性對照為GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒的陽性質粒樣品。?

三重熒光定量RT-PCR檢測用上游引物和下游引物以及相應的特異性探針序列如下：?

上游引物NVGI-F:5’-ATGTTCCGBTGGATGCGSTT-3’?

下游引物NVGI-R：5’-TCCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3’?

特異性探針NVGI-P:5’-FAM-ACAGGRGATCGCRATCTYCTGCC-BHQ1-3’?

上游引物NVGII-F:5’-GARCCNATGTTCAGRTGGATG-3’?

下游引物NVGII-R:5’-CGACGCCATCTTCATTCACA-3’?

特異性探針NVGII-P:5’-HEX-TCACRTGGGAGGGCGATCGCAA-BHQ1-3’?