[實用新型]一種木材中松材線蟲核酸快速提取裝置

有效

• 申請號: 201220581808.X
• 申請日: 2012-11-07
• 公開（公告）號: CN203007255U
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 詹國輝;張兆麟;陳云芳;顧見明
• 申請（專利權）人: 蘇州市外來有害生物防控技術中心
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00;C12M1/12
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 邱興天

技術領域

本實用新型屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種木材中松材線蟲核酸快速提取裝置。?

背景技術

目前檢測松材線蟲方法主要有以下幾種：?

（1）形態學鑒別法：將疑似染有松材線蟲的木材用刀具劈開成小條狀，然后將條狀木材置于下部漏斗狀玻璃容器中，在玻璃器皿的下部漏斗出口處套一根橡皮管，在管上加一彈簧夾夾緊，在玻璃容器中加水使木條浸滿，靜止數天，使松材線蟲從木材中游離到水中并沉入到漏斗出口處，放開彈簧夾將底部含蟲的水放入玻璃皿內，在顯微鏡下觀察，以形態學特征診斷松材線蟲。此法的最大缺點是，耗時長、效率低、形態學鑒別具有不確定性。在日本，Mamiya等早在1979年就提出了采用尾部的尾尖突來區分松材線蟲和擬松材線蟲，這也是目前兩種線蟲鑒別中的主要形態學依據。由于北美的松材線蟲有些群體中的雌蟲尾部也有尾尖突，因此從形態上要將兩者正確區分開來對一些非專業從事植物線蟲分類的人員是非常困難的。

（2）酶測定法：谷氨酸草酰乙酸轉氨酶是可區分兩種線蟲的酶，松材線蟲分泌的纖維素酶的譜帶類型與擬松材線蟲的纖維素酶的不同，酯酶同功酶和蘋果酸脫氫酶譜，也可以區別松材線蟲和擬松材線蟲。由于酯酶的穩定性并不好，同一株系在不同菌上培養后也有變化。這可能與酶本身易受外界環境條件如培養線蟲的條件(濕度和溫度等)?、提取過程及提取物的貯藏條件、分析方法及線蟲本身即線蟲的各發育階段或在某一階段線蟲的生理狀況的影響有關。因此，酶雖然在密切相關的種類間保持著高度保守性，但由于上述因素，利用電泳分析線蟲蛋白易導致結果的不穩定性。該方法復雜、繁瑣、不穩定、特異性差，無實際應用價值。?

（3）免疫學方法：主要有多克隆抗體和單克隆抗體技術，用多克隆抗體酶聯免疫法測定，雖然EL?ISA的敏感度高，但種間區分度并不好，這跟多克隆抗體的特異性差有關。用單克隆抗體方法在一些重要的植物寄生線蟲的鑒定中已有成功先例，如Arjen?Schots等應用單克隆抗體技術區分出馬鈴薯金線蟲(Globodera?rostochiensis)和馬鈴薯白線蟲(G.pallida)，其他如大豆孢囊線蟲(Het2erodera?glycines)和南方根結線蟲(M.?incog2nita)也有過單克隆抗體技術的應用。?

（4）激素測定法：松材線蟲與擬松材線蟲產生的性外激素具有種特異性，即松材線蟲或擬松材線蟲只有各自的雌蟲才能吸引各自相應的雄蟲，這是各自雌蟲釋放性外激素引起的反應。因此可利用測定性外激素來區分兩者。松材線蟲與擬松材線蟲產生的性外激素具有種特異性，即松材線蟲或擬松材線蟲只有各自的雌蟲才能吸引各自相應的雄蟲，這是各自雌蟲釋放性外激素引起的反應。因此可利用測定性外激素來區分兩者。?

（5）脂類測定方法：Krusberg等(1973)報道，南方根結線蟲和花生根結線蟲的成熟雌蟲和卵的脂肪酸性質相同，但是兩種線蟲中某種脂肪酸的含量不同，因此可以以此來區分兩種線蟲。但目前尚未見有用脂類來區分松材線蟲與擬松材線蟲的報道，在這方面是否可行，也可進行一番嘗試。?

（6）核酸測定法：隨著近幾年分子生物學技術的迅猛發展，以DNA為基礎的診斷，在線蟲分類鑒定中的作用與日俱增，在許多植物線蟲類群中已建立了較成熟的分子診斷系統。目前已經有比較成熟的PCR和RT-qPCR的試劑盒供應。?

在核酸測定法中，從生物中提取核酸的方法甚多，目前提取核酸的方法主要有以下幾種：?

（1）有機提取法?；驹恚罕椒邮沟鞍鬃冃裕琒DS裂解細胞膜，蛋白酶K和EDTA消化蛋白或多肽或小肽，核蛋白變性降解使DNA從核蛋白中游離出來。利用DNA易溶于水，不溶于有機溶劑的特性提取DNA。

（2）螯合樹脂法?；驹恚阂灾饕褂玫尿蠘渲琧helex-100為例，其含有成對的亞氨基二乙酸鹽離子，對高價金屬離子有很高的親和力和螯合作用。在低離子強度、堿性及煮沸下可以使細胞膜裂解，并使蛋白變性，DNA游離。?

（3）無機提取法?；驹恚豪肗aCI或醋酸鈉沉淀蛋白，經離心，用無水乙醇沉淀提取DNA。?

（4）差異裂解提取法?；驹恚豪媚承┥飿颖镜募毎ひ子谄扑?，另一些生物樣本的細胞不容易破碎的特點，使用常規方法先去除易于破碎細胞，再用特殊試劑裂解不容易破碎細胞，再提取其中的DNA。?

（5）磷酸鹽緩沖液法?；驹恚杭毎诤请x子去垢劑和蛋白酶K的溶液中消化后，高溫加熱使蛋白質及蛋白酶K失活，離心沉淀分離蛋白質，從離心上清液中提取DNA。?